范金波，邢 莉，李孟雨，麻 奧，呂長(zhǎng)鑫，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

蜂膠是一類獨(dú)特的黏合劑和樹(shù)脂物質(zhì)，具有多種生物學(xué)活性[1]。黃酮類與酚酸類化合物在其中大量存在，使其具備豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，然而目前只對(duì)少部分蜂膠活性成分進(jìn)行過(guò)研究[2]?？Х人幡?苯乙醇酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）在蜂膠生物活性成分中占重要地位，具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗微生物、抗炎和抗氧化等一系列的生物活性，尤其在抗癌方面表現(xiàn)出很大的潛力[3-7]。目前已有研究者利用化學(xué)方法合成了CAPE，解決了從蜂膠中提取時(shí)提取率低的問(wèn)題[8]。CAPE屬于酚類衍生物，穩(wěn)定性差，生物利用度低，常使用蛋白質(zhì)作為載體實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用[9-11]。

人血清蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中濃度最高的載體蛋白，能和各種內(nèi)源性與外源性的分子進(jìn)行結(jié)合并遞送，例如脂肪酸、營(yíng)養(yǎng)素、類固醇以及許多常用藥物如華法林和布洛芬等[12]，成為了當(dāng)前研究最為普遍的蛋白之一。HSA是單肽鏈的蛋白，由585 個(gè)氨基酸殘基組合而成，17 個(gè)二硫鍵有助于維持其心形形狀。HSA由3 個(gè)同源結(jié)構(gòu)域構(gòu)成（I、II、III），各結(jié)構(gòu)域又可細(xì)分為A和B兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，芳香族和雜環(huán)配體分子分別結(jié)合到亞結(jié)構(gòu)域IIA（site I）和IIIA（site II）的疏水腔，具有特定的生理活性[13-14]。位于亞結(jié)構(gòu)域IIA（Trp 214）的色氨酸殘基，其熒光強(qiáng)度對(duì)小分子配體敏感，因此常被用作探針，監(jiān)測(cè)該位點(diǎn)上配體與HSA的結(jié)合情況[15]。Li Hongliang等[16]采用多光譜和分子對(duì)接技術(shù)研究了CAPE與HSA的特異性結(jié)合作用，并與前人研究的蜂膠組分對(duì)比發(fā)現(xiàn)pH 7.4條件下，CAPE對(duì)HSA具有較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光猝滅作用，CAPE與HSA結(jié)合能力顯著強(qiáng)于其他蜂膠活性成分。

目前，CAPE參與人體循環(huán)系統(tǒng)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程的詳細(xì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不清楚，CAPE與HSA生理?xiàng)l件下結(jié)合作用已有報(bào)道，但不同pH值對(duì)CAPE與HSA結(jié)合作用的影響鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)熒光發(fā)射光譜探究pH值對(duì)CAPE與HSA結(jié)合行為的影響，通過(guò)同步熒光光譜分析CAPE結(jié)合對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)位點(diǎn)Marker實(shí)驗(yàn)確定兩者的結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為CAPE活性穩(wěn)態(tài)化保持、靶向遞送提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HSA（99%） 北京百靈威科技有限公司；CAPE（98%）、華法林（98%）、布洛芬（98%） 生工生物工程（上海）股份有限公司；檸檬酸、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立高新技術(shù)公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q Reference型超純水機(jī) 德國(guó)默克密理博有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制

配制0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 3.0、5.0和7.4），并配制1.2×10-4mol/L的HSA儲(chǔ)備液，以及濃度為7.2×10-4mol/L CAPE、華法林、布洛芬儲(chǔ)備液。

1.3.2 CAPE與HSA相互作用的熒光光譜測(cè)定

熒光發(fā)射光譜：取7 支離心管，先加入不同pH值的緩沖溶液，再加入1.2×10-4mol/L HSA 30 μL，最后加入一定體積7.2×10-4mol/L CAPE，得到3 mL的混合溶液，使之充分反應(yīng)20 min。最終HSA濃度為1.2 μmol/L，CAPE濃度為0～14.4 μmol/L。分別在298 K和310 K溫度下，設(shè)置激發(fā)和發(fā)射光柵分別為2.5 nm和5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，以700 nm/min的掃描速率，對(duì)290～450 nm的發(fā)射光譜進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。

同步熒光光譜：在298 K和310 K溫度下，λEx和λEm的波長(zhǎng)間隔分別設(shè)為Δλ=60 nm和Δλ=15 nm，激發(fā)光柵為2.5 nm和發(fā)射光柵為5 nm條件下，對(duì)波長(zhǎng)250～350 nm的同步光譜進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3 CAPE與HSA的結(jié)合位點(diǎn)分析

參照1.3.2節(jié)方法，在加入CAPE前，先加入華法林/布洛芬充分搖勻反應(yīng)20 min，使其濃度為6.0 μmol/L，后續(xù)操作與1.3.2節(jié)相同。并設(shè)置對(duì)照組。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CAPE對(duì)HSA熒光強(qiáng)度的影響

如圖1所示，在298 K時(shí)，3 種pH值條件下CAPE對(duì)HSA均產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象，隨著CAPE濃度的增加（0～14.4 μmol/L）熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性的減弱，峰形無(wú)顯著變化。在pH 3.0時(shí)，HSA的熒光強(qiáng)度峰值降低了43%；pH 5.0時(shí)，HSA的熒光強(qiáng)度峰值降低了40%；pH 7.4時(shí)，HSA的熒光強(qiáng)度峰值降低了78%。不同pH值條件下，最大發(fā)射波長(zhǎng)（λmax）出現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，pH 3.0時(shí)發(fā)生微弱藍(lán)移（327～326 nm），pH 5.0時(shí)發(fā)生微弱紅移（338～339 nm），pH 7.4時(shí)發(fā)生紅移（339～343 nm），可能是由于pH值和CAPE對(duì)HSA共同作用使熒光發(fā)色團(tuán)附近的微環(huán)境發(fā)生了變化，紅移使極性增強(qiáng)。由圖1D所示，猝滅率隨著CAPE濃度的增大而增大，其中pH 7.4時(shí)的猝滅率明顯高于pH 3.0和pH 5.0，差異顯著（P＜0.05）；而pH 3.0和pH 5.0相比，差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 298 K條件下pH值對(duì)CAPE與HSA結(jié)合熒光光譜的影響Fig.1 Effect of pH on fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 298 K

如圖2所示，310 K時(shí)，在3 種pH值條件下CAPE對(duì)HSA均產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象，且峰形未發(fā)生明顯變化。當(dāng)pH 3.0、5.0和7.4時(shí)，HSA的熒光強(qiáng)度峰值分別降低了43%、62%和81%。pH值變化影響了λmax，pH 3.0、5.0和7.4時(shí)，隨著CAPE濃度的增加λmax分別紅移6 nm（325～331 nm）、紅移8 nm（336～344 nm）和紅移3 nm（337～340 nm）。這表示CAPE與HSA發(fā)生了相互作用，加之pH值的影響改變HSA的結(jié)構(gòu)，使熒光基團(tuán)附近的微環(huán)境產(chǎn)生變化，極性增強(qiáng)。由圖2D可知，相同CAPE濃度下，猝滅率隨著pH值的升高而增大，pH 7.4時(shí)最高，pH 3.0時(shí)最低，說(shuō)明pH值影響了CAPE與HSA的結(jié)合作用。

圖2 310 K條件下pH值對(duì)CAPE與HSA結(jié)合熒光光譜的影響Fig.2 Effect of pH on fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 310 K

2.2 熒光猝滅機(jī)理和結(jié)合常數(shù)

HSA與小分子之間的熒光猝滅類型主要分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)[17]。靜態(tài)猝滅的過(guò)程是猝滅分子和HSA在基態(tài)形成了不發(fā)光的物質(zhì)；動(dòng)態(tài)猝滅是HSA的激發(fā)態(tài)分子和猝滅分子發(fā)生了碰撞，返回到基態(tài)，2 種方式均可以使HSA的熒光強(qiáng)度降低。靜態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)Ksv和溫度呈反比，動(dòng)態(tài)猝滅呈正比。本實(shí)驗(yàn)采用Stern-Volmer方程（1）和Acharya方程（2）分析熒光猝滅機(jī)理[18]。

式中：F0和F分別為未加和加入CAPE時(shí)熒光強(qiáng)度；[Q]為CAPE的濃度/（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)；τ0為熒光團(tuán)的平均壽命，為10-8s；Ksv為猝滅常數(shù)；Ka為結(jié)合常數(shù)。

R2值越接近于1，證明數(shù)據(jù)越精確。根據(jù)方程（1），可計(jì)算不同條件下CAPE與HSA結(jié)合的猝滅常數(shù)Ksv。由表1可知，在pH 3.0、5.0、7.4條件下，Ksv均隨溫度上升而增大，但由于Kq均遠(yuǎn)大于2×1010L/（mol·s）（生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)），說(shuō)明CAPE對(duì)HSA的猝滅類型是靜態(tài)猝滅[19-20]。相同溫度條件下（310 K）pH值變化影響了Ksv，且隨著pH值的升高而出現(xiàn)增加趨勢(shì)，pH 7.4時(shí)Ksv出現(xiàn)最大值，驗(yàn)證了圖2的結(jié)果。結(jié)合常數(shù)Ka在不同條件下都為104～106數(shù)量級(jí)，證明二者的結(jié)合能力較強(qiáng)。pH值變化顯著影響了結(jié)合常數(shù)，在生理?xiàng)l件（pH 7.4）下最大。

表1 CAPE與HSA相互作用常數(shù)Table 1 Interaction constants of CAPE with HSA

2.3 熱力學(xué)性質(zhì)和作用力類型

小分子和HSA之間主要基于氫鍵、范德華力、疏水相互作用和靜電相互作用4 種作用力結(jié)合[21]。在298 K和310 K溫度下通過(guò)Van’t Hoff方程（3）和熱力學(xué)方程（4）計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)[22]：

式中：K1、K2對(duì)應(yīng)T1（298 K）、T2（310 K）時(shí)的結(jié)合常數(shù)；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔG為結(jié)合反應(yīng)的吉布斯自由能變化/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol?K））；R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol?K））；溫差較小時(shí)，ΔH可作為常數(shù)[23]。

從理論上講，當(dāng)ΔH＜0或ΔH≈0和ΔS＞0時(shí)，靜電相互作用扮演交互的主要力量；當(dāng)ΔH＞0，ΔS＜0時(shí)，主要基于靜電和疏水相互作用結(jié)合；ΔH＜0，ΔS＜0時(shí)，氫鍵與范德華力作為交互的主要力量；ΔH＞0，ΔS＞0時(shí)，疏水作用起主要作用[24-25]。由表2可知，ΔH＜0，ΔG增加（ΔG＜0），ΔS＜0，說(shuō)明CAPE與HSA之間的結(jié)合是熵減少，吉布斯自由能升高，自發(fā)進(jìn)行的放熱過(guò)程，二者間的作用力表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。

表2 CAPE與HSA相互作用的熱力學(xué)常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of interaction between CAPE and HSA

2.4 同步熒光光譜測(cè)定

在298 K和310 K溫度下測(cè)定不同配體濃度的HSA同步熒光光譜。當(dāng)λEx和λEm的波長(zhǎng)間隔設(shè)定在15 nm時(shí)反映酪氨酸殘基的光譜信息；設(shè)定在60 nm反映色氨酸殘基的光譜信息[26-27]。酪氨酸和色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)（λmax）均與附近微環(huán)境的極性相關(guān)，若λmax藍(lán)移，則周圍環(huán)境的疏水性增強(qiáng)；反之極性增強(qiáng)[28]。所以能夠依據(jù)λmax的改變，判斷CAPE的參與對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變[29]。

如圖3所示，298 K溫度下，無(wú)論Δλ=15 nm還是Δλ=60 nm，CAPE的參與對(duì)HSA都存在猝滅作用，而且隨CAPE濃度逐步升高，HSA熒光強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，pH 3.0與pH 7.4條件下，對(duì)應(yīng)的酪氨酸殘基的吸收峰微弱藍(lán)移1 nm和2 nm，pH 5.0時(shí)未發(fā)生位移；當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，pH 5.0和pH 7.4條件下，色氨酸殘基的吸收峰藍(lán)移1 nm和6 nm，pH 5.0時(shí)未發(fā)生位移。且伴隨pH值的增大，色氨酸最大吸收峰的降低趨勢(shì)更加明顯。表明CAPE的加入，加之pH值的影響，使色氨酸附近微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，極性減弱[30]。

圖3 298 K及pH 3.0（A）、pH 5.0（B）、pH 7.4（C）時(shí)CAPE對(duì)HSA的同步熒光光譜的影響Fig.3 Effects of different pHs on synchronous fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 298 K

如圖4所示，310 K溫度下，伴隨CAPE濃度的升高，酪氨酸與色氨酸殘基內(nèi)源熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)規(guī)律性地降低，與圖3呈現(xiàn)出相似的規(guī)律。當(dāng)Δλ為15 nm時(shí)，pH 5.0和pH 7.4條件下，對(duì)應(yīng)酪氨酸殘基的吸收峰微弱藍(lán)移1 nm和2 nm，pH 3.0時(shí)未發(fā)生位移；當(dāng)Δλ為60 nm時(shí)，pH 3.0和pH 7.4條件下，色氨酸殘基的吸收峰藍(lán)移1 nm和3 nm，pH 5.0時(shí)紅移1 nm。由此能夠推測(cè)，2 種氨基酸殘基附近的微環(huán)境均產(chǎn)生了微弱的變化。且色氨酸最大吸收峰的降低趨勢(shì)隨pH值的增大更為明顯，pH 7.4時(shí)最明顯。綜上所述，HSA中的酪氨酸殘基與色氨酸殘基比較，后者的熒光強(qiáng)度減弱的更顯著。說(shuō)明色氨酸殘基可能比酪氨酸殘基更接近于結(jié)合位點(diǎn)，CAPE的加入和pH值的共同影響改變了HSA的構(gòu)象。

圖4 310 K及pH 3.0（A）、pH 5.0（B）、pH 7.4（C）時(shí)CAPE對(duì)HSA的同步熒光光譜的影響Fig.4 Effects of different pHs on synchronous fluorescence spectra of HSA bound to CAPE at 310 K

2.5 CAPE與HSA結(jié)合位點(diǎn)的分析

華法林和布洛芬均能夠特異性地與HSA結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)分別位于HSA的亞結(jié)構(gòu)域IIA（Sudlow’s site I）和亞結(jié)構(gòu)域III A（Sudlow’s site II）。本實(shí)驗(yàn)選擇布洛芬和華法林作為位點(diǎn)Marker，通過(guò)比較位點(diǎn)Marker存在時(shí)猝滅率的變化判斷CAPE與HSA的結(jié)合位點(diǎn)[31]。

由圖5可以得出，二者的存在均顯著降低了CAPE與HSA的結(jié)合，華法林存在時(shí)產(chǎn)生的熒光猝滅變化比布洛芬更顯著。結(jié)果說(shuō)明CAPE與HSA的結(jié)合位點(diǎn)位于亞結(jié)構(gòu)域IIA和IIIA之間，更接近于Sudlow’s site I。

圖5 298 K、pH 7.4布洛芬和華法林對(duì)CAPE與HSA結(jié)合的影響Fig.5 Effects of IBUP and WARF on binding between CAPE and HSA at 298 K and pH 7.4

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法研究CAPE與HSA在pH 3.0、5.0、7.4條件下的結(jié)合作用，經(jīng)過(guò)分析計(jì)算出猝滅常數(shù)、猝滅類型、結(jié)合常數(shù)、作用力類型，再通過(guò)同步熒光探究3 種pH值條件下CAPE對(duì)HSA構(gòu)象的影響，最后位點(diǎn)Marker實(shí)驗(yàn)確定結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明3 種pH值條件下CAPE對(duì)HSA均產(chǎn)生了熒光猝滅現(xiàn)象，類型為靜態(tài)猝滅，pH 7.4時(shí)具有最強(qiáng)的猝滅作用，同時(shí)結(jié)合常數(shù)最大，說(shuō)明生理?xiàng)l件下CAPE與HSA更容易結(jié)合；熱力學(xué)參數(shù)表明CAPE與HSA主要通過(guò)范德華力和氫鍵作用結(jié)合；同步熒光表明CAPE和pH值的共同影響改變了HSA的構(gòu)象；位點(diǎn)Marker實(shí)驗(yàn)表明，CAPE與HSA的結(jié)合位點(diǎn)位于Sudlow’s site I附近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，pH值的增加促進(jìn)了CAPE與HSA的結(jié)合，這對(duì)于探究蜂膠生物活性成分在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及為蛋白基-CAPE載體的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。