司曉喜，張鳳梅，劉志華，陳 歡，何 沛，劉春波，楊建云，付亞寧，許志剛，朱瑞芝,*

（1.云南省煙草化學(xué)重點實驗室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450001；3.昆明理工大學(xué)理學(xué)院，云南 昆明 650500）

薄荷醇是一種廣泛使用的調(diào)味劑和藥物成分[1-6]，其結(jié)構(gòu)有3 個手性碳，有8 種旋光異構(gòu)體（4 對對映異構(gòu)體），分別是D/L-薄荷醇、D/L-新薄荷醇、D/L-異薄荷醇和D/L-新異薄荷醇[7]，8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。不同構(gòu)型的薄荷醇具有不同的呈香性和生物效用，其中L-薄荷醇具有明顯的薄荷香氣和清涼作用，并可用作刺激藥，應(yīng)用價值最大，而其他薄荷醇異構(gòu)體則帶有明顯的霉味等不良?xì)庀⒒虼碳ば訹8-11]。不同來源的薄荷醇由于異構(gòu)體含量和構(gòu)型組成不同[12]，產(chǎn)生的薄荷香氣、涼感和藥用功效具有差異，特別是L-薄荷醇純度較低時，嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)。建立薄荷醇異構(gòu)體構(gòu)型分析技術(shù)對含薄荷醇產(chǎn)品的質(zhì)量控制、品質(zhì)評價具有重要價值。

圖1 8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagrams of eight menthol optical isomers

目前，有關(guān)薄荷醇含量測定和應(yīng)用技術(shù)開發(fā)已有大量報道[13-14]，對薄荷醇異構(gòu)體則主要關(guān)注D-薄荷醇和L-薄荷醇對映體的分離，采用的分離檢測方法主要有手性柱分離-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-18]、柱前衍生化-反向高效液相色譜法[19]、正向液相色譜法[20]等，其中以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測法最為簡單便捷。Chen Cai等[15]采用手性毛細(xì)管氣相色譜柱、頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分離檢測了煙草制品中的D-薄荷醇和L-薄荷醇，并進一步采用二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜篩查其他薄荷醇異構(gòu)體，但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品并未能準(zhǔn)確識別其他薄荷醇異構(gòu)體。Heumann等[21]利用手性試劑衍生化、19F核磁共振譜實現(xiàn)了8 種薄荷醇異構(gòu)體的分離和定性，但該方法需要復(fù)雜的前處理和多步化學(xué)反應(yīng)步驟，難于用于復(fù)雜樣品基質(zhì)中薄荷醇異構(gòu)體的分離和定量檢測。對復(fù)雜基質(zhì)中8 種薄荷醇異構(gòu)體的分離檢測仍然是個難題，由于缺乏薄荷醇旋光異構(gòu)體的分析方法，無法準(zhǔn)確獲得含薄荷醇產(chǎn)品中薄荷醇旋光異構(gòu)體存在和分布情況的完整信息。

本實驗通過研究不同固定相的毛細(xì)管氣相色譜柱對8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體的分離效能，擬建立薄荷醇旋光異構(gòu)體的串聯(lián)手性毛細(xì)管柱分離、氣相色譜-質(zhì)譜檢測法測定，并用于不同類型含薄荷醇食品、藥品中薄荷旋光異構(gòu)體的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售16 種含薄荷醇藥品（Y1～Y16，其中Y1～Y6為皮膚外用油，Y7～Y11為片劑，Y12為吸入劑，Y13為顆粒，Y14～Y15為外用膏劑，Y16為貼膏）；市售25 種含薄荷醇糖果（T1～T25，其中T1～T14為硬質(zhì)糖果，T15～T19為軟糖，T20～T25為膠基型口香糖）。

甲醇、無水乙醇（均為色譜純） 德國Merck公司；8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸苯乙酯信息參見表1。

表1 8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)信息Table 1 Information about 8 menthol optical isomer standards and internal standards

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus 600氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Perkin Elmer公司；KQ-700 V型超聲波清洗器（配有溫控功能，功率≥200 W） 昆山市超聲儀器有限公司；BT224S電子天平（感量0.000 1 g） 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；3K15高速臺式離心機 德國Sigma公司；0.22 μm有機系濾膜 天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；彈性毛細(xì)管氣相色譜柱見表2。

表2 實驗用毛細(xì)管色譜柱Table 2 List of capillary columns used in this stuty

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

配制系列質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的8 種薄荷醇異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)使內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為20.0 μg/mL。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，藥品樣品以含20.0 μg/mL乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)的乙酸乙酯作萃取劑，糖類食品以含20.0 μg/mL乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)的甲醇作萃取劑，樣品量和溶劑用量比例一般為1∶100（g/mL）（溶劑用量根據(jù)樣品中薄荷醇異構(gòu)體含量進行調(diào)整），加蓋密閉后于常溫下超聲萃取，片劑藥品、顆粒藥品、貼膏、硬質(zhì)糖果、軟糖萃取時間為10 min，外用膏劑萃取時間為5 min，吸入劑、外用油、膠基型口香糖萃取時間2 min，萃取完成后萃取液轉(zhuǎn)移至離心管，以8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機系濾膜后進樣分析。若樣品中薄荷醇異構(gòu)體含量超過標(biāo)線質(zhì)量濃度范圍，用萃取劑稀釋后再進行測定。不加入樣品，按照同樣的前處理方法，進行空白實驗。

1.3.3 分析條件

氣相色譜條件：進樣口溫度200 ℃；傳輸線溫度230 ℃；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；進樣量1 μL；分流進樣（分流比10∶1）。DB-5MS、DB-624、DBALC1和DB-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱，程序升溫條件：初始溫度60 ℃，以5 ℃/min的速率升至120 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min，載氣流速DB-624柱為2.0 mL/min，其余為1.0 mL/min。BGB-175、CycloSil-B手性毛細(xì)管色譜柱，程序升溫條件：初始溫度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升至100 ℃，以1 ℃/min的速率升至130 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，載氣流速為1.0 mL/min。CycloSil-B+BGB-175串聯(lián)手性毛細(xì)管柱，升溫程序條件：初始溫度50 ℃，以3 ℃/min的速率升至120 ℃，保持16 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持10 min，載氣流速1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲8 min；檢測方法：總離子流掃描和選擇離子監(jiān)測模式，8 種薄荷醇異構(gòu)體的監(jiān)測離子均為m/z71、81、95（定量離子m/z71），乙酸苯乙酯的監(jiān)測離子為m/z104、91（定量離子m/z91）。

1.3.4 定量計算

對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各薄荷醇旋光異構(gòu)體的定量離子峰面積與乙酸苯乙酯定量離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)，各薄荷醇旋光異構(gòu)體的質(zhì)量濃度和乙酸苯乙酯質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。樣品中各薄荷醇旋光異構(gòu)體的質(zhì)量濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出，樣品中各薄荷醇旋光異構(gòu)體的含量按下式計算：

式中：X為各薄荷醇旋光異構(gòu)體的含量/（mg/g）；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣中各薄荷醇旋光異構(gòu)體的質(zhì)量濃度/（mg/L）；C0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的空白中各薄荷醇旋光異構(gòu)體的質(zhì)量濃度/（mg/L）；V為萃取液體積/L；M為試樣質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗中所有數(shù)據(jù)采用平均值表示，所有指標(biāo)均重復(fù)測定3 次；采用Origin 2017軟件進行不同樣品中薄荷醇異構(gòu)體構(gòu)型比例的主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件考察

2.1.1 常規(guī)色譜柱分離薄荷醇旋光異構(gòu)體測定

薄荷醇極性較小，常采用非極性或弱極性毛細(xì)管氣相色譜柱進行分離，也有報道極性和中等極性色譜柱能實現(xiàn)薄荷醇的分離并獲得良好的峰形，定量分析時通常以L-薄荷醇或外消旋的薄荷醇為標(biāo)準(zhǔn)品進行含量計算[22-26]。實驗研究了常用非極性的DB-5MS柱、中等極性的DB-624柱、極性的DB-INNOWAX柱、特殊鍵合固定相DBALC1柱對8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體分離的效果，見圖2?？梢钥闯觯趦?yōu)化的色譜分離條件下，以上4 種色譜柱均對薄荷醇有良好的保留，實現(xiàn)4 對薄荷醇對映異構(gòu)體D/L-薄荷醇、D/L-新薄荷醇、D/L-異薄荷醇、D/L-新異薄荷醇的分離，但不能實現(xiàn)每對對映體D型和L型旋光異構(gòu)體的分離。對于薄荷醇的4 對對映異構(gòu)體，物理性質(zhì)如蒸汽壓和沸點在同一對映體對內(nèi)相同，但非對映體不同，而以上固定相對對映異構(gòu)體無選擇性，因而不能分離同一對映體。對比不同的固定相，不同薄荷醇對映異構(gòu)體的流出順序不同，分離度也存在差異，其中極性DB-INNOWAX柱分離4 對薄荷醇對映異構(gòu)體的效果最佳。根據(jù)以上分離情況可知，采用非手性柱分離測定薄荷醇含量時，只包含了D/L-薄荷醇，忽略了其中所含的其他對映異構(gòu)體新薄荷醇、異薄荷醇和新異薄荷醇。

圖2 常規(guī)色譜柱DB-5MS（a）、DB-624（b）、DB-ALC1（c）和DB-INNOWAX（d）分離8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of eight menthol optical isomer standards separated on conventional columns such as DB-5MS (a),DB-624 (b), DB-ACL1 (c) and DB- INNOWAX (d)

2.1.2 手性柱分離薄荷醇旋光異構(gòu)體測定

環(huán)糊精類固定相由于獨特分子結(jié)構(gòu)及多個不同的碳手性中心，具有廣泛的手性識別能力，但天然環(huán)糊精熔點高、成膜性能差，故常對其進行衍生和選擇性修飾，提高手性識別的程度和應(yīng)用范圍，已成為最為廣泛應(yīng)用的手性固定相。目前已有較多的研究報道采用環(huán)糊精類毛細(xì)管氣相色譜柱實現(xiàn)部分薄荷醇旋光異構(gòu)體的分離，認(rèn)為薄荷醇的六元環(huán)部分伸入到環(huán)糊精疏水性空腔內(nèi)，不同手性中心與環(huán)糊精作用力的差異決定了手性識別過程[27-28]。不同環(huán)糊精空腔大小、不同取代基的環(huán)糊精表現(xiàn)出不同的手性分離能力，并可能改變分離物質(zhì)的流出順序[17-18]。根據(jù)已有研究報道，選擇2 種取代基及空腔大小不同的環(huán)糊精手性柱進行研究，分別為含七-(2,3-二-O-甲基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基)-β-環(huán)糊精的CycloSil-B手性柱、含2,3-二-O-乙?；?6-O-叔丁基二甲基硅烷基-γ-環(huán)糊精的BGB-175手性柱，2 種色譜柱對8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體分離的效果見圖3。

圖3 手性色譜柱BGB-175（a）和CycloSil-B（b）分離8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of eight menthol optical isomer standards separated on chiral columns BGB-175 (a) and CycloSil-B columns (b)

從圖3可以看出，除BGB-175手性柱未能完全分離D/L-異薄荷醇對映體外，其余對映異構(gòu)體均能實現(xiàn)手性拆分，但由于柱效限制，不同對映異構(gòu)體的D型和L型異構(gòu)體色譜峰會發(fā)生重疊，從而不能實現(xiàn)8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體的完全分離。從圖3還可以看出，兩根色譜柱對部分薄荷醇旋光異構(gòu)體的保留具有差異，即流出順序不同，例如在CycloSil-B色譜柱上未能實現(xiàn)分離的L-新薄荷醇和D-薄荷醇，以及D-異薄荷醇和L-異薄荷醇，在BGB-175色譜柱上則有較好的分離度。

2.1.3 柱串聯(lián)技術(shù)分離薄荷醇異構(gòu)體研究及分離效果評價

由于單根色譜柱的柱效有限，以上實驗結(jié)果及已有報道均表明單一的手性色譜柱未能實現(xiàn)8 種薄荷旋光異構(gòu)體的完全分離，即使通過增加色譜柱長度提高柱效也難于實現(xiàn)重疊峰的分離，而采用分離性能不同或互補的兩根或多根色譜柱串聯(lián)，則可能提高分離效果[29]。氣相色譜串聯(lián)技術(shù)簡易的解決方案是采用色譜柱連接器直接將兩根柱子串聯(lián)，根據(jù)上述實驗結(jié)果，CycloSil-B手性柱和BGB-175手性柱對8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體的分離能力具有差異并呈現(xiàn)互補，并且二者規(guī)格適配，因此研究了雙柱串聯(lián)對薄荷醇旋光異構(gòu)體的分離能力。結(jié)果顯示，CycloSil-B+BGB-175雙柱串聯(lián)能實現(xiàn)8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體的分離，分離色譜圖見圖4。

圖4 串聯(lián)手性色譜柱CycloSil-B＋BGB-175分離8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatogram of eight menthol optical isomer standards separated on tandem chiral columns CycloSil-B + BGB-175

進一步通過色譜分離度和柱效率等對CycloSil-B+BGB-175雙柱串聯(lián)分離薄荷醇旋光異構(gòu)體的效能進行評價。從圖4可以看出，除峰5（D-新異薄荷醇）和峰7（D-異薄荷醇）達(dá)到基本分離外，其余色譜峰均達(dá)到完全分離，滿足分離要求。通過計算對稱因子對色譜峰的對稱性進行評價，8 種色譜峰的對稱因子均在0.8～1.0，除L-新薄荷醇色譜峰略微前伸，其余色譜峰對稱性較好，表明兩根色譜柱兼容性較好，并能與薄荷醇異構(gòu)體產(chǎn)生較強的作用力保證其在兩相中分配平衡，以保持色譜峰的對稱性。穩(wěn)定性方面，8 種薄荷醇選異構(gòu)體的峰面積和保留時間均具有較好的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性。此外，柱流失也是影響信噪比（RSN）的關(guān)鍵因素，通過檢測中爐溫120 ℃、高爐溫200 ℃時的基線噪聲強度和柱流失質(zhì)譜圖評價柱流失情況。雙柱串聯(lián)在120 ℃爐溫時柱流失變化不大，高溫時柱流失增加，但與單柱相比柱流失變化不明顯，通過基線的質(zhì)譜圖主要識別出甲基聚硅氧烷的典型柱流失離子m/z207、73、281、355，以及改性環(huán)糊精上取代基叔丁基二甲基硅基等基團斷裂的碎片離子m/z75、89、57，但以上柱流失碎片離子與薄荷醇的定性、定量離子（m/z71、81、95）均不重疊，對薄荷醇異構(gòu)體的分離檢測無明顯影響。采用建立的雙柱串聯(lián)分離方法，用于含薄荷醇的藥品、糖類食品等不同基質(zhì)樣品的檢測，代表性樣品檢測的選擇離子流色譜圖見圖5，可以看出不同樣品中色譜峰分離情況良好，表明CycloSil-B+BGB-175雙柱串聯(lián)滿足不同樣品中薄荷醇旋光異構(gòu)體分離檢測要求。

圖5 含薄荷醇的藥品（a）、糖類食品（b）和標(biāo)準(zhǔn)溶液（c）的選擇離子流色譜圖Fig.5 Chromatograms of menthol in drug (a) and candy (b) and standard solution (c) under selected ion monitoring mode

2.2 定量方法建立和評價

采用以上優(yōu)化的方法，取系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣分析，以各薄荷醇異構(gòu)體的定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物乙酸苯乙酯定量離子峰面積的比值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不含薄荷醇的藥品和糖果的樣品測定20 次，以空白響應(yīng)的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作檢出限，10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作定量限。選取含薄荷醇的代表性藥品和糖果，按照上述實驗方法處理后測定，以7 次平行樣測定結(jié)果計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。取不含薄荷醇的藥品和糖果，添加低、中、高3 個水平含量的薄荷醇異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行加標(biāo)回收率實驗，其中L-薄荷醇添加質(zhì)量濃度分別為20.0、100.0、200.0 mg/L，其他7 種薄荷醇異構(gòu)體添加質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、2.0 mg/L，結(jié)果列于表3。結(jié)果表明，在所考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，8 種薄荷醇異構(gòu)體的線性相關(guān)系數(shù)（r2）不小于0.998，方法的定量限為23.0～72.9 μg/L，檢測實際樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）不大于4.3%（n=7），加標(biāo)回收率為86.0%～116.0%。

表3 線性相關(guān)系數(shù)、方法的檢出限、定量限、精密度和回收率Table 3 Linear correlation coefficients, limits of detection, limits of quantification, precision and recoveries

2.3 樣品測定結(jié)果

含薄荷醇的藥品和糖果中薄荷醇異構(gòu)體檢測結(jié)果分別見表4、5。16 個含薄荷醇的藥品中檢測到的薄荷醇均以L-薄荷醇為主，除了一個樣品中L-薄荷醇比例為78.9%，其他藥物樣品中L-薄荷醇比例高于96.8%；除了兩個藥物樣品外均檢測到L-薄荷醇以外的其他異構(gòu)體，并呈現(xiàn)不同的異構(gòu)體分布特征，其中D構(gòu)型薄荷醇檢出率高于L構(gòu)型。25 個糖果食品中，L-薄荷醇比例為71.7%～100%，除了5 個糖果樣品外均檢測到L-薄荷醇以外的其他異構(gòu)體，檢出率和含量較高的為D-新薄荷醇。D-新薄荷醇等雖然有一定的清涼感和薄荷味特征，但有較強的土樣或者發(fā)霉的不良?xì)馕?，L-薄荷醇以外的其他薄荷醇異構(gòu)體是否會對食品風(fēng)味和藥效帶來不良影響，還需結(jié)合其閾值等進一步評估[30-31]。

表4 藥物樣品中薄荷醇異構(gòu)體含量和異構(gòu)體純度檢測結(jié)果Table 4 Results of determination of menthol isomer contents and percentages in drug samples

目前報道在天然植物中未發(fā)現(xiàn)D-薄荷醇，并將D-薄荷醇的存在作為天然來源和合成薄荷醇的鑒別指標(biāo)[12]，而本實驗檢測的部分樣品中檢測出微量D-薄荷醇，但是否能判斷以上樣品的薄荷醇來源于合成還需進一步確證。以往的方法由于未能實現(xiàn)D-薄荷醇的良好分離，存在未能檢測到微量D-薄荷醇的可能性。

表5 糖果樣品中薄荷醇異構(gòu)體含量和異構(gòu)體純度檢測結(jié)果Table 5 Results of determination of menthol isomer contents and percentages in candy samples

2.4 不同樣品中薄荷醇異構(gòu)組成的PCA

不同樣品中薄荷醇異構(gòu)體構(gòu)型組成存在差異，進一步對不同樣品中薄荷醇異構(gòu)體構(gòu)型比例進行PCA。從圖6可以看出，通過PCA可以將16 種藥物、25 種糖果類食品按照其中所含薄荷醇的異構(gòu)體比例進行一定的區(qū)分。通過對樣品中薄荷醇異構(gòu)體的構(gòu)型組成分析，可能為薄荷醇的來源鑒定、真?zhèn)螛悠疯b別等提供技術(shù)支持。

圖6 不同藥物（a）和糖果（b）樣品中薄荷醇異構(gòu)體構(gòu)型比例的PCAFig.6 PCA plots of percentages of menthol isomer configurations in different drug (a) and candy (b) samples

3 結(jié) 論

本實驗建立串聯(lián)手性毛細(xì)管柱分離、氣相色譜-質(zhì)譜法檢測8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體的方法，并進行方法評價和驗證。建立的方法分離8 種薄荷醇異構(gòu)體分離度好、響應(yīng)值和保留時間具有較好穩(wěn)定性，成功用于不同類型藥品和糖果類食品中薄荷醇旋光異構(gòu)體的定量分析，并獲得了不同樣品中薄荷醇旋光異構(gòu)體含量和分布的完整信息。所檢測的藥品和糖果中薄荷醇異構(gòu)體均以L-薄荷醇為主，大部分樣品中檢測到微量的其他薄荷醇異構(gòu)體。未來工作中，可進一步結(jié)合覺察閾值等進一步評估薄荷醇異構(gòu)體純度和含量對食品風(fēng)味、藥物藥效等的影響。綜上所述，本實驗所建立的8 種薄荷醇旋光異構(gòu)體的分離和定量檢測方法，在薄荷型食品、含薄荷醇藥物的質(zhì)量控制和評價、薄荷醇產(chǎn)品來源識別等方面具有應(yīng)用價值，并可應(yīng)用于其他類型樣品的分析檢測。