吳 勇綜述 黃書嵐審校

作者單位：430060 武漢，武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科（吳 勇、黃書嵐）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成人最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，中位生存期約15 個月[1]。目前，新診斷的GBM 標(biāo)準(zhǔn)治療包括最大化安全切除、替莫唑胺化療聯(lián)合同步放療等[2]。即使采用綜合治療，很短時間內(nèi)仍不可避免地出現(xiàn)復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。由于腫瘤的異質(zhì)性、化療耐藥性、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）等因素，使得GBM 的傳統(tǒng)治療面臨巨大的挑戰(zhàn)。近年來，嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cells，CAR-T）療法在治療GBM 中取得許多進(jìn)展。本文介紹CAR-T 治療GBM的最新研究進(jìn)展以及面臨的挑戰(zhàn)。

1 CRA-T治療機(jī)制

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）是特殊的人工蛋白，分為細(xì)胞外、跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)三部分，其中胞外部分具有特異性結(jié)構(gòu)域可以識別腫瘤表面相關(guān)抗原，而且不需要依賴主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的介導(dǎo)，從而避免了腫瘤通過下調(diào)MHC 進(jìn)行免疫逃逸；跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)馀c胞內(nèi)結(jié)合為一體，起到信息傳遞的作用；而胞內(nèi)部分包含酪氨酸酶活化序列，可激活T細(xì)胞毒性及增殖，發(fā)揮靶向性的抗腫瘤效果[3]。

經(jīng)過更新迭代，CAR 不斷完善。第1 代CAR 胞內(nèi)僅有1個T細(xì)胞信號結(jié)構(gòu)，只能簡單識別靶細(xì)胞及活化T 細(xì)胞，因此在體內(nèi)存活時間短，抗瘤作用甚微。第2 代CAR 在第1 代的基礎(chǔ)上增加了1 個共刺激分子信號（如CD27、CD28、OX40、4-1BB等），實(shí)現(xiàn)了共刺激分子、胞內(nèi)信號域的雙重活化，使T細(xì)胞可以自我增殖，并釋放一些增強(qiáng)細(xì)胞功能的因子。第3 代CAR 同時擁有2 個共激分子，T 細(xì)胞可持續(xù)增殖，明顯增強(qiáng)了殺傷腫瘤的作用。第4 代CAR 加入了更多的功能元件，包括可控開關(guān)、自殺基因、增強(qiáng)T細(xì)胞功能的分子等。

2 CAR-T治療GBM的可行性和優(yōu)勢

美國食品和藥物管理局在2017 年批準(zhǔn)了兩款CAR-T用于血液惡性腫瘤的臨床治療。鑒于CART 在血液系統(tǒng)腫瘤中突出的療效，越來越多的研究將CAR-T用于實(shí)體腫瘤治療。

顱內(nèi)淋巴管的發(fā)現(xiàn)以及效應(yīng)T 細(xì)胞運(yùn)輸?shù)难芯?，使得中樞神?jīng)作為免疫特區(qū)的概念被推翻，使GBM 的免疫治療有了理論基礎(chǔ)[4]。腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）與腫瘤相關(guān)抗原的豐度呈正相關(guān)。由于膠質(zhì)瘤的TMB相對較低，新抗原不足以使T細(xì)胞識別腫瘤；并且，GBM初級免疫應(yīng)答的產(chǎn)生受到抗原特異性T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)和抗原非依賴性共刺激信號傳導(dǎo)缺陷的限制。而CAR構(gòu)建體包含有共激結(jié)構(gòu)域，不需要刺激初級免疫應(yīng)答。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）對放、化療不敏感，是治療失敗的關(guān)鍵原因。CAR-T 療法對GSCs有效，并有根除這類細(xì)胞的希望。

3 CAR-T在GBM中的具體應(yīng)用

3.1 IL-13Rα2 CAR-T 細(xì)胞IL-13Rα2 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的級別呈正相關(guān)，超過70%的GBM 呈過表達(dá)，正常腦組織幾乎不表達(dá)。高表達(dá)IL-13Rα2，激活Src/PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[5]。IL-13Rα2是細(xì)胞因子IL-13受體中的2 個亞基之一，IL-13 以低親和力結(jié)合IL-13Rα 1，隨后IL-13Rα1 與IL-4Rα形成異二聚體，激活STAT6信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IL-13Rα2以較高的親和力結(jié)合IL-13，是一種誘餌受體，為腫瘤細(xì)胞的凋亡逃逸機(jī)制。

2015年，Brown等[6]通過術(shù)后瘤腔給予第一代靶向性IL-13Rα2 的CAR-T 治療復(fù)發(fā)性GBM 共3 例，最長存活時間約14 個月，其中2 例有客觀的影像學(xué)表現(xiàn)，出現(xiàn)的頭痛和短暫神經(jīng)功能缺損等不良事件可控制；第一代IL-13Rα2 CAR-T 在體內(nèi)存活時間約14 d，缺乏持久性。2018 年，Brown 等[7]在前期的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，開發(fā)出第二代IL-13Rα2 靶向CAR-T，稱為IL-13BBζT，減少脫靶細(xì)胞受體的相互作用，增加了細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)CD137（4-1BB），同時加入用于細(xì)胞追蹤和富集的截短信號CD19（CD19t）；小鼠模型實(shí)驗(yàn)表明IL-13BBζT 比第一代CAR-T 擁有更高、更持久抗腫瘤效應(yīng)，并未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，還發(fā)現(xiàn)腫瘤局部給藥途徑似乎更優(yōu)于靜脈內(nèi)全身給藥。有臨床試驗(yàn)報道[8]，瘤腔內(nèi)先后6 次輸注第二代IL-13Rα2 CAR-T 治療1 例復(fù)發(fā)的多灶GBM，在輸入部位未見腫瘤生長，后因顱內(nèi)其他部位和脊髓新發(fā)腫瘤進(jìn)行10次腦室內(nèi)給藥，第三次腦室給藥后觀察到所有顱內(nèi)和脊髓腫瘤均明顯縮小。Keu等[9]用18F-9-[4-氟-3-（羥甲基）丁基]鳥嘌呤PET分子顯像研究過繼到體內(nèi)CD8+毒性T淋巴細(xì)胞，把單純皰疹病毒1 型胸苷激酶作為酶報告基因標(biāo)記到IL-13Rα2 CAR-T 中，該方法能準(zhǔn)確地監(jiān)測CAR-T細(xì)胞活力、生物分布、運(yùn)輸過程等。

3.2 表皮生長因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ，EGFRvⅢ）靶向CAR-T EGFR 是一種酪氨酸激酶受體，在許多腫瘤中表達(dá)失調(diào)。EGFRvⅢ是最多見的突變體，缺乏與胞外配體相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，因此，該酪氨酸激酶受體不再依賴配體，可以持續(xù)激活多條下游的信號通路（如PI3K、Ras 等），從而引起腫瘤細(xì)胞增殖、血管新生、侵襲等一系列反應(yīng)[10]。EGFRvⅢ在約30%的GBM 中呈陽性表達(dá)，而在正常組織中無表達(dá)，因此成為治療GBM的安全可行的有效靶點(diǎn)。

Morgan 等[11]開發(fā)了第三代EGFRv Ⅲ靶向性CAR-T，以CD28-41BB-CD3ζ作為T 細(xì)胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，可特異性識別GSCs 和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并對培養(yǎng)的正常組織細(xì)胞無影響。在GBM模型小鼠中，EGFRvⅢ靶向性CAR-T 可以有效通過BBB 到達(dá)腫瘤區(qū)，表現(xiàn)出抗腫瘤功效[12]。鄭巖等[13]也成功構(gòu)建了第三代EGFRvⅢ靶向性CAR-T，對EGFRvⅢ陽性U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞有特異殺傷效果。O'Rourke 等[14]首先進(jìn)行EGFRvⅢ靶向性CAR-T的臨床試驗(yàn)，靜脈輸注EGFRvⅢ靶向性CAR-T 治療復(fù)發(fā)性GBM 共10例，部分病人出現(xiàn)腫瘤外毒性和細(xì)胞因子釋放綜合征，中位生存期為8 個月，1 例無進(jìn)展生存期達(dá)到18個月以上。大多數(shù)EGFRvⅢ陽性GBM 在復(fù)發(fā)時維持EGFRvⅢ陽性，而一部分病人卻發(fā)生變化，因此對于接受EGFRvⅢ靶向治療的GBM病人，建議重復(fù)活檢并重新評估EGFRvⅢ狀態(tài)[15]。目前，EGFRvⅢ靶向性CAR-T 治療復(fù)發(fā)性GBM 療效和安全性的臨床試驗(yàn)（NCT02209376、NCT01454596）仍在進(jìn)行中。

3.3 人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）靶向CAR-T HER2 是一種跨膜糖蛋白，屬于EGFR 家族，HER2 致癌基因存在于編碼HER2 蛋白的17 號染色體的長臂，可以通過多個信號通路影響細(xì)胞增殖和凋亡。HER2 表達(dá)與GBM的預(yù)后有著密切關(guān)系[16]，因此，HER2是GBM病人CAR-T 治療的另一個重要靶點(diǎn)。但是有案例報道顯示，1例轉(zhuǎn)移性腸癌接受CAR-T療法后死亡，原因是CAR識別肺上皮細(xì)胞中低水平表達(dá)的HER2所致，因此其安全性受到關(guān)注[17]。

Ahmed等[18]通過編碼HER2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)活化T 細(xì)胞獲得HER2 靶向性CAR-T，發(fā)現(xiàn)HER2 靶向CAR-T 可殺死HER2 陽性GBM 細(xì)胞和CD133陽性干細(xì)胞，具有顯著抗腫瘤活性。HER2靶向CAR-T 的一期臨床試驗(yàn)（NCT01109095）已經(jīng)完成[19]，17例均是HER2陽性復(fù)發(fā)性或進(jìn)展性GBM，通過靜脈給予HER2靶向CAR-T，1例出現(xiàn)超過9個月的部分反應(yīng)，7例具有8周至29個月的無進(jìn)展期，治療后和診斷后的中位生存期分別為11.1 個月、24.5個月，試驗(yàn)未觀察到劑量限制性毒性，2 例出現(xiàn)2 級癲癇和/或頭痛。

3.4 酪氨酸蛋白激酶受體2（ephrinA2 receptor EphA2）靶向CAR-T EphA2 在許多腫瘤中過表達(dá)，EphA2與相應(yīng)的配體結(jié)合后通過Ras/ERK和PI3/Akt途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡。EphA2 在大部分GBM中呈過表達(dá)，并且與預(yù)后相關(guān)，使其成為治療GBM的極具吸引力的靶點(diǎn)[20]。

Chow 等[21]研究發(fā)現(xiàn)EphA2 靶向CAR-T 可以誘導(dǎo)產(chǎn)生γ-干擾素和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2，對腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性；12只模型小鼠顱內(nèi)注入2×106個EphA2 靶向CAR-T 后，生物發(fā)光成像顯示腫瘤信號明顯減弱，小鼠存活時間延長；降低輸入的EphA2 靶向CAR-T 細(xì)胞數(shù)后也發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤效應(yīng)，但是通過靜脈途徑輸入方式未觀察到抗腫瘤作用。有學(xué)者對EphA2特異性CAR進(jìn)行修飾，獲得優(yōu)化的EphA2靶向CAR-T，抗腫瘤活性增加了20倍[22]。 EphA2 靶 向 CAR- T 的 臨 床 試 驗(yàn)（NCT02575261）已經(jīng)完成，目前未公布試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

4 CAR-T治療GBM面臨的挑戰(zhàn)與方向

4.1 抗原異質(zhì)性與抗原逃逸GBM 抗原異質(zhì)性是免疫治療耐藥的主要原因。IL-13Rα2 靶向CAR-T 和EGFRvⅢ靶向CAR-T 治療后均發(fā)現(xiàn)靶向抗原的丟失，腫瘤進(jìn)展[4，15]。有學(xué)者設(shè)計(jì)了HER2和IL-13Rα2的雙靶點(diǎn)CAR-T，發(fā)現(xiàn)具有更有效的識別腫瘤能力和更加持久的抗瘤活性[23]。目前，已經(jīng)研究出三價CAR-T，可以克服抗原異質(zhì)性，并改善治療效果[24]。4.2 腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境存在很多因素抑制T細(xì)胞的應(yīng)答，為了應(yīng)對微環(huán)境產(chǎn)生的免疫抑制因子，例如TGF-β、IL-6、IL-10、IL-23等，一種方法是開發(fā)小分子抑制劑和相應(yīng)的抗體。GBM 會累積許多抑制性白細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、髓樣抑制細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等，用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子中和髓樣抑制細(xì)胞，通過節(jié)律化療、阻斷CD25 等方法抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞作用。目前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可明顯提高免疫治療的效果[25]。

4.3 安全性與BBB CAR-T 的毒性主要包括腫瘤溶解綜合征、細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性、靶標(biāo)毒性等，安全性是免疫治療首要考慮的。目前，有研究將分子開關(guān)、自殺基因?qū)氲紺AR 中，增強(qiáng)CAR-T的安全性。為預(yù)防“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，有學(xué)者用化學(xué)分子開關(guān)將CAR 的抗原識別部分和信號傳導(dǎo)部分分開，只有在小分子配體（AP21967）存在時被激活[26]，如此依據(jù)AP21967的劑量和作用時間來調(diào)節(jié)T細(xì)胞的毒性和細(xì)胞因子的釋放。BBB的存在使通過外周血進(jìn)入腫瘤的效應(yīng)T細(xì)胞不足10%，是限制CART療效的重要原因。提高BBB的通透性和改變輸注途徑可以明顯改善抗瘤效應(yīng)[7]。

綜上所述，CAR-T療法給GBM治療提供了一個新的研究方向，但是仍需要進(jìn)一步研究GBM的分子機(jī)制，尋找最優(yōu)的靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)更多靶點(diǎn)、通用型、增強(qiáng)型的CAR-T，以及聯(lián)合其他治療方法。