王逸凡，代蓉，晏雪梅，李爽，李秀芳

(云南中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室，昆明 650500)

中性粒細(xì)胞是體內(nèi)最豐富的白細(xì)胞，約占已發(fā)現(xiàn)人體循環(huán)血液中白細(xì)胞總量的60%[1]。中性粒細(xì)胞作為機體固有免疫防疫系統(tǒng)的重要組成部分，可在有毒顆粒蛋白和活性氧類的幫助下，吞噬和殺死與之相適應(yīng)的細(xì)胞外病原體[2]，也可以通過分泌毒性蛋白和酶[髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和防御素等]對抗細(xì)胞外微生物。此外，中性粒細(xì)胞可將活性氧類和一些促炎細(xì)胞因子釋放到細(xì)胞外微環(huán)境中，協(xié)助先天免疫反應(yīng)[3]。因此，中性粒細(xì)胞構(gòu)成了機體抵抗有害病原微生物入侵的一道防線。但近10年的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞是更為復(fù)雜的細(xì)胞，不僅具有先天免疫應(yīng)答的效應(yīng)功能，還具有通過與細(xì)胞因子直接相互作用或產(chǎn)生細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力[4-6]。2004年，Brinkmann等[7]首次發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞對抗感染的另一種方式，即形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs是經(jīng)刺激活化的中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)成分釋放至胞外而形成的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，NETs在捕獲和滅活細(xì)菌、真菌和病毒方面起關(guān)鍵作用，但NETs過量聚集時，其對機體的保護作用易轉(zhuǎn)為損害作用[5]?，F(xiàn)從NETs的結(jié)構(gòu)、標(biāo)志物、抗菌抗病毒及呼吸系統(tǒng)相關(guān)炎性疾病等方面進一步闡述NETs在呼吸道免疫過程中的雙向作用，為進一步探究NETs在上呼吸道感染向下呼吸道遷延進程中的關(guān)鍵作用提供新思路。

1 NETs的形成

與凋亡和壞死不同，NETs形成是一種新的中性粒細(xì)胞程序性死亡方式，是一個多步驟的死亡途徑，被稱為NETosis[7-8]。通過將中性粒細(xì)胞與抗死亡受體——Fas抗體孵育后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡的中性粒細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)縮合、細(xì)胞核破碎以及細(xì)胞質(zhì)空泡化，而核膜和細(xì)胞器保持完整。壞死中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)破壞，核小葉融合成均質(zhì)團塊，但未分離成常染色質(zhì)和異染色質(zhì)。與凋亡和壞死的中性粒細(xì)胞相比，NETs最顯著的形態(tài)學(xué)差異是中性粒細(xì)胞核膜與胞質(zhì)顆粒膜溶解，染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)顆粒內(nèi)容物的融合以及胞質(zhì)細(xì)胞器的消失[9-10]。

目前已發(fā)現(xiàn)的NETs形成方式主要有自殺式NETosis和活性NETosis兩種。在自殺式NETosis中，中性粒細(xì)胞在受到促炎介質(zhì)、過氧化物等刺激后2～4 h內(nèi)活化，活化的成熟中性粒細(xì)胞呈扁平狀，并黏附于基底面，核染色體解聚，分葉結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)、外核膜分離，顆粒膜、核膜消失，細(xì)胞核質(zhì)、細(xì)胞胞質(zhì)與顆粒成分融合，細(xì)胞變圓收縮直至胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物呈網(wǎng)狀排出[10]。12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇是常用的自殺式NETosis誘導(dǎo)劑，可通過激活蛋白激酶C活化泛素連接酶-促分裂原活化的蛋白激酶-胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，進而促發(fā)NETs釋放[11]。腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-8等促炎介質(zhì)也能通過激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸信號誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生[12]。此外，中性粒細(xì)胞在受到高遷移率族蛋白B1、脂多糖、革蘭陰性菌等刺激后，還可形成活性的NETosis，但并不在5～60 min內(nèi)出現(xiàn)核膜或質(zhì)膜破裂?；钚訬ETosis受到刺激后，細(xì)胞核的小葉和多核形狀消失，細(xì)胞內(nèi)外膜分離且囊泡出芽。細(xì)胞質(zhì)與質(zhì)膜融合后釋放到胞外與DNA結(jié)合[13-14]，此時中性粒細(xì)胞仍具有活性并能夠吞噬病原體[15]?；钚訬ETosis依賴于Toll樣受體和補體蛋白的參與[16]。

研究表明，NETs的形成需依賴胞內(nèi)NE和MPO。NE和MPO協(xié)同易位至細(xì)胞核內(nèi)，降解組蛋白，使染色體去濃縮，促進組蛋白瓜氨酸化[9]。NE缺陷型小鼠不能形成NETs，表現(xiàn)出免疫缺陷。臨床研究發(fā)現(xiàn)，MPO活性缺乏患者不能生成NETs[17]，除NE和MPO外，細(xì)胞內(nèi)肽?；彼崦搧啺访?也被認(rèn)為是NETs形成必不可少的因素。在NETs形成過程中，組蛋白高度纖維化介導(dǎo)染色質(zhì)去致密化是其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵[18]，而肽?；彼崦搧啺访?催化去除組蛋白H3精氨酸殘基上帶正電荷的-NH2基團，促進組蛋白修飾轉(zhuǎn)變成瓜氨酸化組蛋白，以削弱核小體中組蛋白和DNA之間的緊密靜電結(jié)合，隨后DNA骨架解螺旋，與抗菌蛋白顆粒結(jié)合，使細(xì)胞破裂和NETs釋放[9]。研究表明，NETs存在于多種脊椎動物(人、小鼠和半滑舌鰨魚)中[19-21]。

2 NETs的結(jié)構(gòu)及標(biāo)志物

通過電子掃描和共聚焦顯微鏡以及蛋白質(zhì)組學(xué)分析對NETs的詳細(xì)解析顯示，NETs由薄的染色質(zhì)纖維組成，其中包含約30種中性粒細(xì)胞蛋白，包括NE、殺菌/通透性增強蛋白、防御素、抗菌肽LL-37、蛋白酶3和粒細(xì)胞來源的組織蛋白酶G以及核組蛋白[22]。這些鑲嵌在DNA骨架上的蛋白增加了NETs局部殺菌濃度。NETs占據(jù)的體積可超過其來源細(xì)胞體積的10～15倍，且有多種形態(tài)，如絲狀結(jié)構(gòu)、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、云狀結(jié)構(gòu)[23]。NETs主要依靠其獨特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)捕獲病原體，主要由球狀結(jié)構(gòu)及光滑延伸的脆弱纖維組成，這種獨特的結(jié)構(gòu)為NETs發(fā)揮生物學(xué)作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。脫氧核糖核酸酶可降解網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故認(rèn)為核DNA是NETs結(jié)構(gòu)的支柱[24]。NETs的相關(guān)文獻指出，NE從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并通過降解組蛋白促使染色質(zhì)去濃縮，而組蛋白的瓜氨酸化介導(dǎo)染色質(zhì)去濃縮和NETs形成[18,25]。綜上所述，核DNA、NE以及組蛋白可作為NETs的特征標(biāo)志物。

3 NETs在呼吸道中的雙向作用

中性粒細(xì)胞抵抗病原體的經(jīng)典途徑主要通過趨化移行，從血管移至炎癥部位，吞噬病原變?yōu)橥淌审w[26]，吞噬體與細(xì)胞內(nèi)含有酸性水解酶和抗菌肽的特殊溶酶體相互作用，結(jié)合成吞噬溶酶體后被分解。而NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可防止病原體的擴散，并維持抗菌物質(zhì)在感染部位的聚集，更好地發(fā)揮清除和殺滅一些病原體及其毒力因子的作用[8]。NETs作為機體先天性免疫的重要環(huán)節(jié)，在抵抗御病原體侵襲方面起積極作用。當(dāng)病原體入侵機體時，NETs能迅速形成并遷移到感染部位，捕獲并限制病原體，再通過高濃度的抗菌分子殺滅病原體，為機體提供有效的抗菌防御保障。此外，NETs還可能作為免疫效應(yīng)和促炎因子的來源，促進組織損傷和自身免疫[27]，NETs的形成伴有大量胞內(nèi)和核內(nèi)自身抗原的暴露[28]，若NETs過度形成或未及時清除，其富含水解酶和DNA的粘連網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)附著于內(nèi)皮，可引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，直接導(dǎo)致組織損傷，同時也可通過釋放抗菌肽LL-37、α干擾素等內(nèi)源性危險信號，誘導(dǎo)自身免疫[29]。研究表明，體內(nèi)過度形成NETs與許多呼吸系統(tǒng)疾病的病理過程有關(guān)[30]。

3.1NETs的防御功能

3.1.1抗菌作用 NETs在防御各種細(xì)菌方面起著至關(guān)重要的作用。除了捕獲和殺死細(xì)菌外，NETs活性成分也可以中和毒力因子。例如，NETs中大量的組蛋白通過增強細(xì)菌膜的通透性促進抗微生物肽形成膜孔，并阻礙細(xì)菌膜修復(fù)，從而使其具有抗菌特性[31-32]。此外，來自福氏志賀菌的侵襲性質(zhì)粒抗原IpaB和IcsA(用于細(xì)胞-細(xì)胞擴散)可被NE降解[33-34]?，F(xiàn)已證實，NETs可在體外有效降解細(xì)菌，包括許多與呼吸系統(tǒng)增殖和感染相關(guān)的細(xì)菌，如銅綠假單胞菌[35]、肺炎鏈球菌[36]、金黃色葡萄球菌[7]、嗜血桿菌[37]、組A鏈球菌[38]和大腸埃希菌[39]。在早期肺炎球菌肺炎小鼠肺泡中，也可觀察到NETs。更重要的是，NETs捕獲細(xì)菌的能力減弱了細(xì)菌從上呼吸道向下呼吸道的遷移，降低了細(xì)菌擴散到血液中的可能性[40]。由此可見，NETs有助于防御細(xì)菌性呼吸道感染。

3.1.2抗真菌作用 與NETs抗菌功能相比，目前對NETs在真菌感染中作用的認(rèn)識尚淺。Urban等[41]報道稱，鈣衛(wèi)蛋白作為NETs中的主要抗真菌成分，參與宿主防御白色念珠菌。鈣衛(wèi)蛋白是中性粒細(xì)胞中最突出的胞質(zhì)蛋白，約占所有胞質(zhì)蛋白的50%，它通過螯合二價金屬離子抑制真菌的生長[42]。因此推測，鈣衛(wèi)蛋白是防御真菌感染的有效成分。實驗證明，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶缺乏導(dǎo)致的慢性肉芽腫病中，中性粒細(xì)胞不能在肺中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以應(yīng)對煙曲霉菌性肺炎[43]。故認(rèn)為，NETs能增強宿主抗真菌能力。

3.1.3抗病毒作用 盡管細(xì)菌和真菌因粒徑較大不能穿過NETs而被捕獲，小病毒粒子理論上可以逃離誘捕網(wǎng)的包圍。但有研究指出，體外NETs捕獲病毒能夠降低宿主細(xì)胞的感染性，表明NETs有助于防御病毒性疾病的傳播[44]。如最典型的嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的病原體——呼吸道合胞病毒可誘導(dǎo)Toll樣受體4依賴的NETs。NETs能夠捕獲呼吸道合胞病毒，從而減弱病毒顆粒與靶細(xì)胞的結(jié)合并防止感染[45]。除了簡單地捕獲病毒粒子外，NETs還具有直接的抗病毒活性[46]。從NETs中捕獲的病毒顆粒表現(xiàn)出較低的傳染性，NETs的這種直接抗病毒作用可能通過暴露出網(wǎng)中的顆粒蛋白(如MPO和防御素)而介導(dǎo)[47]。

3.2NETs對呼吸道的損傷作用 NETs在呼吸道的宿主防御中具有潛在的有益抗病性功能，當(dāng)出現(xiàn)廣泛、失衡的中性粒細(xì)胞招募和激活時，中性粒細(xì)胞的保護作用很容易轉(zhuǎn)向損傷作用，并導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病。

3.2.1NETs與急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS) ALI是由多種誘因引起的以急性、進行性呼吸功能不全為特點的一種常見臨床危重癥，嚴(yán)重時表現(xiàn)為ARDS，即由各種非心源性內(nèi)外致病因素(如嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、吸入有害氣體、中毒)導(dǎo)致的急性、進行性、缺氧性呼吸功能不全或衰竭[48]。ALI/ARDS是由于直接或間接的過度肺部損傷和全身性炎癥反應(yīng)所致，其中NETs發(fā)揮重要作用[49]。在ALI/ARDS急性期，激活的肺泡巨噬細(xì)胞分化為具有促炎作用的M1表型。M1型巨噬細(xì)胞釋放有毒物質(zhì)(如一氧化氮、超氧化物和基質(zhì)金屬蛋白)破壞組織，同時M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-α和γ干擾素也會激活中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞在ARDS的急性炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生NETs[50]。

NETs上布滿了蛋白質(zhì)復(fù)合物，這些蛋白質(zhì)黏附在氣道上，加重了肺部損傷。Wan等[51]研究表明，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成可能導(dǎo)致體外肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，表明網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對肺泡-毛細(xì)血管屏障有直接的毒性作用。在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中，肺泡上皮細(xì)胞以及毛細(xì)血管中均存在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[52]。在機械性通氣引起的肺損傷以及輸血相關(guān)性的ALI動物模型中，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)廣泛存在于肺微血管內(nèi)[53-54]。因此，NETs對呼吸道和肺部的間接損傷可能在呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。

3.2.2NETs與氣道阻塞 除直接損傷肺組織外，NETs的形成也會導(dǎo)致更多的間接并發(fā)癥。富含DNA和蛋白質(zhì)的黏液所致氣道阻塞是許多慢性呼吸系統(tǒng)疾病[如囊性纖維化、哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)]的病理特征之一。研究證實，慢性呼吸系統(tǒng)疾病的黏液栓主要來源于中性粒細(xì)胞，以DNA、NE、MPO、Cith3蛋白復(fù)合物以及其他中性粒細(xì)胞蛋白復(fù)合體的方式沉積在NETs中，而NETs中的高水平DNA可以增強黏液的黏彈性，導(dǎo)致氣道阻塞和細(xì)菌繁殖[55-57]。當(dāng)調(diào)節(jié)跨氣道上皮層的碳酸氫鹽和氯化物分泌平衡的囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的功能被破壞時，囊性纖維化患者的中性粒細(xì)胞凋亡延遲，這種細(xì)胞凋亡延遲使囊性纖維化中性粒細(xì)胞能更有效地形成NETs[58]。NETs的過度形成促使肺泡中的黏液變得黏稠，進而促使細(xì)菌(如流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌以及大量銅綠假單胞菌)的定植[59]。這種定植促進了NETs的中性粒細(xì)胞的浸潤，使痰液黏度增加，從而降低患者的呼吸能力。

CXC趨化因子受體2是一種G蛋白偶聯(lián)受體，它以高親和力結(jié)合CXC趨化因子配體，如CXC趨化因子配體8/白細(xì)胞介素-8。CXC趨化因子配體8/白細(xì)胞介素-8被認(rèn)為是COPD氣道分泌物中吸引中性粒細(xì)胞的主要趨化因子[60]。此外，當(dāng)COPD病情加重時，中性粒細(xì)胞上調(diào)并與CXC趨化因子及其互補受體結(jié)合，特別是CXC趨化因子受體1/2，從而在氣道黏膜中激活和募集[61]。同時CXC趨化因子受體2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)COPD中性粒細(xì)胞的NETs的產(chǎn)生。CXC趨化因子受體2阻斷劑AZD5069能夠限制COPD患者離體血液和痰中NETs的形成[62]。另有研究表明，呼吸道合胞病毒通過磷脂酰肌醇-3-激酶和核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活中性粒細(xì)胞，并抑制抗氧化酶的表達(dá)，引起氣道黏膜炎癥和細(xì)胞氧化損傷[63-64]。除上述機制外，融合蛋白F通過激活Toll樣受體4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)級反應(yīng)誘導(dǎo)活性氧類的產(chǎn)生及胞外信號調(diào)節(jié)激酶和p38促分裂原活化的蛋白激酶的磷酸化反應(yīng)，釋放MPO和NE包裹的NETs[65]。NETs與脫落的上皮細(xì)胞和大量中性粒細(xì)胞共定位于密集的細(xì)胞栓塞中，從而引起氣道阻塞[45]。在融合蛋白F刺激下，DNA纖維上表達(dá)的NE和MPO通過破壞結(jié)締組織，降解內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，加重肺部呼吸道合胞病毒感染，導(dǎo)致感染后組織損傷[66]。由此可見，在慢性呼吸系統(tǒng)疾病中，NETs參與了一些特征性病理表現(xiàn)的形成，如蛋白堆積使分泌物變得厚重而黏稠，影響肺換氣功能，從而誘發(fā)或加重感染。

3.2.3NETs與結(jié)核病 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的主要侵襲肺部的慢性傳染病，患病率和病死率較高[67]。通常進入肺部的病菌能夠被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬并殺死，但結(jié)核分枝桿菌能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存。在結(jié)核分枝桿菌感染早期，炎癥細(xì)胞被募集到肺部，并抑制結(jié)核分枝桿菌生長，此時結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)展為潛伏性感染，肺實質(zhì)肉芽腫的形成保證了芽孢桿菌與宿主防御的平衡。當(dāng)機體免疫力降低時，機體的免疫反應(yīng)不能抑制結(jié)核分枝桿菌生長，肉芽腫病變增加，潛伏性結(jié)核發(fā)展為活動性結(jié)核[68]。有證據(jù)表明，中性粒細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染后最早遷移至局部組織中的細(xì)胞，也是肺結(jié)核患者氣道中最豐富的白細(xì)胞[69]。在早期肉芽腫形成期，中性粒細(xì)胞被迅速募集到受感染的肺部，成為結(jié)核分枝桿菌的宿主[70]。當(dāng)中性粒細(xì)胞受到兩種結(jié)核分枝桿菌基因型(H37Rv和M.canetti)的刺激時，中性粒細(xì)胞釋放嵌有NE和組蛋白的NETs[71]。NETs僅能捕獲結(jié)核分枝桿菌，但不能殺死結(jié)核分枝桿菌，這可能加重結(jié)核病的肺部損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌分泌的早期分泌性抗原靶6 kDa蛋白誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌從吞噬體逃逸到細(xì)胞質(zhì)，并誘導(dǎo)NETs的形成[72]。中性粒細(xì)胞在活動性結(jié)核病患者肺肉芽腫中釋放高水平的鈣衛(wèi)蛋白[73]，該蛋白是NETs的組成成分之一[41]。中性粒細(xì)胞釋放的鈣衛(wèi)蛋白與NETs的結(jié)合不受限制。由此可見，結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的NETs加重了結(jié)核病患者的肺部損傷。

4 小 結(jié)

呼吸道感染作為常見的臨床疾病，其疾病進程與預(yù)后一直是臨床研究的焦點，但目前針對NETs在呼吸道中作用的研究較少。NETs可作為有益的抗微生物誘捕網(wǎng)起作用，但過度形成的NETs不僅未對疾病進程起到緩解作用，反而加重了組織損傷。此外，NETs參與抑制和殺滅黏膜上皮組織的病原微生物，但其相關(guān)作用及機制尚不明確，尤其是對呼吸道中鼻黏膜組織的研究非常有限，且上呼吸道NETs大量形成的原因仍需深入研究。因此，尋找NETs保護性和不良反應(yīng)性之間的平衡點有助于未來探尋呼吸系統(tǒng)疾病防治的新療法。