張凌燕，阮祥燕

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100026)

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性患病率最高的惡性腫瘤，也是我國(guó)女性癌癥死亡的最常見原因[1]。Perou等[2]分析了包含8 102個(gè)基因的互補(bǔ)DNA芯片，通過檢測(cè)雌激素受體、孕激素受體和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，HER)2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了乳腺癌的4個(gè)分子亞型，并用于分層靶向治療。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一類基于分子分型的特殊類型乳腺癌，2005年首次對(duì)TNBC進(jìn)行了描述[3]。由于TNBC缺乏雌激素受體、孕激素受體和HER2，因此無(wú)法接受激素或抗HER2藥物治療。TNBC具有特殊的生物學(xué)表達(dá)和臨床病理特性，其病理特點(diǎn)包括高分級(jí)、浸潤(rùn)性擴(kuò)散以及高有絲分裂率，表現(xiàn)為高級(jí)別的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及區(qū)域性壞死，TNBC的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均高于其他類型乳腺癌[4]。有證據(jù)表明，表觀遺傳調(diào)控可能在乳腺癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有助于乳腺癌的異質(zhì)性和轉(zhuǎn)移，尤其是TNBC[5]。表觀遺傳學(xué)研究是在不改變DNA序列的情況下研究基因表達(dá)的可遺傳變化，而表觀遺傳學(xué)是T細(xì)胞分化的關(guān)鍵機(jī)制[6]。Schoenborn等[7]證明，輔助性T細(xì)胞1和輔助性T細(xì)胞2是不同的譜系，而不是細(xì)胞因子表型移位。最早記錄的表觀遺傳學(xué)修飾是DNA甲基化和組蛋白修飾[8]，其他還包括非編碼RNA和染色質(zhì)重構(gòu)?，F(xiàn)就TNBC的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展予以綜述。

1 DNA甲基化與TNBC

DNA甲基化是細(xì)胞進(jìn)化的先決條件，也是許多病理機(jī)制發(fā)生的根源。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methylation transferases，DNMTs)主要在選定基因啟動(dòng)子的CpG二核苷酸環(huán)境中催化胞嘧啶-C5的甲基化，其中DNMT1負(fù)責(zé)復(fù)制后甲基化模式的維持，DNMT3a和DNMT3b啟動(dòng)從頭甲基化[9]。通過DNA甲基化分析檢測(cè)乳腺癌的靈敏度是利用細(xì)胞學(xué)檢測(cè)乳腺癌的2倍，將DNA甲基化分析與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)相結(jié)合，檢測(cè)乳腺癌的準(zhǔn)確度可達(dá)100%[10]。有研究通過分析69個(gè)癌癥相關(guān)基因中110個(gè)CpG島的高甲基化發(fā)現(xiàn)，TNBC中含有5個(gè)基因的甲基化和11個(gè)基因的非甲基化，其中甲基化DNA-蛋白質(zhì)半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、復(fù)制后DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)、DNA結(jié)合蛋白抑制劑ID-4與TNBC的相關(guān)性最強(qiáng)[11]。最全面的TNBC甲基化分析可以根據(jù)不同甲基化區(qū)域?qū)⒒颊邩颖痉謱訛槿齻€(gè)不同水平，TNBC甲基化程度與預(yù)后相關(guān)[12]。與高甲基化組相比，低甲基化組患者在診斷后的前5年生存率更高，而中甲基化組患者的生存率最低；同時(shí)，最全面的TNBC甲基化分析鑒定出17個(gè)獨(dú)立的不同甲基化區(qū)域，根據(jù)這些不同的甲基化區(qū)域可將TNBC患者分為預(yù)后良好和預(yù)后不良組；其中甲基化區(qū)域包括Wilms腫瘤蛋白基因及Wilms腫瘤蛋白反義基因，Wilms腫瘤蛋白及其反義基因高水平的甲基化與TNBC生存率低相關(guān)；雙向啟動(dòng)子的高甲基化與Wilms腫瘤蛋白及Wilms腫瘤蛋白反義基因表達(dá)減少、存活率提高有關(guān)[13]。然而，這些發(fā)現(xiàn)仍有待更大的隊(duì)列研究證實(shí)。

約30%的TNBC患者具有乳腺癌基因(breast cancer gene，BRCA)1突變，且通常預(yù)后較差[14]。10%～20%的TNBC患者存在種系BRCA突變，在野生型BRCA患者中，同源重組的體細(xì)胞突變也能產(chǎn)生類似的突變表型，這種狀態(tài)被稱為BRCAness[12]。同源重組的體細(xì)胞突變可能是由BRCA1基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化導(dǎo)致[14]。癌癥基因組圖譜網(wǎng)絡(luò)描述了基底細(xì)胞型乳腺癌的低甲基化表型，該亞型的DNA甲基化程度最低，且與80%的細(xì)胞瘤抗原p53突變相關(guān)，且常與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白和BRCA的缺失相關(guān)[15]。在TNBC與非TNBC中，BRCA1和BRCA2啟動(dòng)子的甲基化無(wú)顯著差異，而非甲基化基因DNA結(jié)合蛋白抑制劑ID-4是BRCA1的負(fù)調(diào)控因子[16]，這可能成為一種新的BRCA沉默機(jī)制。

乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells，BCSCs)是TNBC侵襲性的重要驅(qū)動(dòng)因素，通過研究啟動(dòng)子甲基化對(duì)BCSCs的調(diào)控，可闡明DNA甲基化在TNBC中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與BCSCs特性相關(guān)的CD44、CD133和Musashi-1啟動(dòng)子區(qū)域在原發(fā)性乳腺癌中被低甲基化，與TNBC及侵襲性乳腺癌相關(guān)[17]。Li等[18]從MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)中篩選出CD44+/CD24 BCSCs群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCSCs與非BCSCs的DNA及組蛋白甲基化均存在差異，特別是組蛋白3第4位賴氨酸的二甲基化(trimethylation of lysine 4 on histone H3，H3K4me2)和組蛋白3第27位賴氨酸的三甲基化(trimethylation of lysine 27 on histone 3，H3K27me3)在BCSCs中均減少，而H3K4me2、H3K27me3減少可能影響Wnt和促性腺激素釋放激素信號(hào)通路。雖然BCSCs在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性和致瘤能力，但具體機(jī)制仍有待闡明。

2 組蛋白修飾與TNBC

組蛋白修飾是組蛋白翻譯后的共價(jià)鍵改變，可以激活或沉默基因表達(dá)，影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄，是重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志。組蛋白修飾包括甲基化、磷酸化、乙?；?、泛素化和蘇酰化等。H3K4me1、H3K4me3、H3K9me3、H3K9ac、H3K27me3、H3K27ac、H3K36me3、H3K79me2八種關(guān)鍵性組蛋白修飾已在13個(gè)細(xì)胞系中被證實(shí)，其中的4個(gè)細(xì)胞系為TNBC MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468和HCC1937[5]。一些組蛋白N端修飾與基因啟動(dòng)子區(qū)的激活或沉默有關(guān)，組蛋白H3在賴氨酸殘基9和27(H3K9me3、H3K27me3)被多梳抑制復(fù)合物2甲基化是沉默染色質(zhì)的標(biāo)志，賴氨酸乙?；?H3K9ac、H3K18ac、H4K12ac)、賴氨酸三甲基化(H3K4me3)、精氨酸二甲基化(H4R3me2)等特異性修飾是基因活化的標(biāo)志，而賴氨酸甲基化(H3K9me2或H3K9me3和H4K20me3)通常與基因沉默有關(guān)[19]。

雖然TNBC的組蛋白修飾機(jī)制尚不完全清楚，但基于此理論基礎(chǔ)的治療已在臨床前研究中取得了一定進(jìn)展。表觀遺傳療法是基于組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的理論基礎(chǔ)。HDAC從組蛋白中去除乙酰基，調(diào)控細(xì)胞凋亡及相關(guān)分化蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的穩(wěn)定性；同時(shí)，通過調(diào)控腫瘤抑制因子，誘導(dǎo)生長(zhǎng)阻滯和分化[19]。HDAC抑制劑目前正在實(shí)體和血液惡性腫瘤中進(jìn)行研究，可多途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)，如通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D的表達(dá)，對(duì)抗淋巴管生成，抑制TNBC的淋巴轉(zhuǎn)移；通過增加周期蛋白依賴性激酶抑制因子的表達(dá)，減少細(xì)胞周期蛋白的含量，進(jìn)而將腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期或G2期，從而阻止腫瘤細(xì)胞的增殖或生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。研究表明，HDAC抑制劑亞磺酰苯胺異羥肟酸和丁酸鈉均可抑制TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231和BT-549中p53突變體的細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并下調(diào)轉(zhuǎn)錄[21]。奧拉帕尼和HDAC抑制劑(NCT023794、NCT01349959)聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同抑制表達(dá)功能性人類第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的TNBC細(xì)胞的生長(zhǎng)，且奧拉帕尼與HDAC抑制劑的聯(lián)合作用在異體移植模型中已得到證實(shí)[22]，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3 非編碼RNAs與TNBC

大數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄分析表明，在約80%的人類基因組中只有約2%編碼蛋白質(zhì)[17]。因此，絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組包含的非編碼RNAs在各種基因表達(dá)調(diào)節(jié)和其他生物學(xué)過程作用中起重要作用。根據(jù)非編碼RNAs的大小、結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)特性其可分為兩類，即長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)和長(zhǎng)度<200個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNAs，其中短鏈非編碼RNAs又包括微RNA(microRNAs，miRNAs)、小核仁RNAs和Piwi蛋白相互作用RNAs[23]。miRNAs由于在腫瘤的生物發(fā)生、轉(zhuǎn)移及治療等領(lǐng)域均具有重要意義而被廣泛研究，而lncRNAs已成為發(fā)育過程(包括乳腺發(fā)育)的關(guān)鍵調(diào)控因子，lncRNAs失調(diào)與包括乳腺癌在內(nèi)的各種癌癥的發(fā)生有關(guān)。

3.1lncRNAs與TNBC 對(duì)TNBC患者的微陣列分析研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，許多l(xiāng)ncRNAs的表達(dá)模式不同[24]，但lncRNAs的具體功能、作用途徑及重要意義還有待進(jìn)一步闡明。有研究報(bào)道了4個(gè)不同的lncRNAs集簇，第一個(gè)集簇幾乎完全由基底樣亞型組成，其中HOTAIR M1(HOXA transcript antisense RNA，myeloid-specific 1)在該簇中過表達(dá)[25]，但HOTAIR M1的作用仍有待確定。另一個(gè)有前景的lncRNAs靶點(diǎn)為Fox-1同源物1基因啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄體，F(xiàn)ox-1同源物1可能是一種負(fù)責(zé)基底樣腫瘤侵襲性表型的促癌基因[26]。HOTAIR是一種通過H3K27甲基化與乳腺癌侵襲性進(jìn)展相關(guān)的lncRNAs，HOTAIR在MCF-7-TNR細(xì)胞中上調(diào)，MCF-7-TNR細(xì)胞是管腔型MCF-7細(xì)胞的基底樣衍生物；另外，HOTAIR與其伴侶zeste同源物2形成復(fù)合物，在基底樣TNBC表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)HOTAIR或zeste同源物2受到抑制時(shí)，管腔型及基底樣標(biāo)志物的表達(dá)均減少，MCF-7-TNR細(xì)胞的增殖受到抑制[27]。

一項(xiàng)關(guān)于TNBC患者組織樣本中l(wèi)ncRNAs的微陣列圖譜研究發(fā)現(xiàn)，TNBC中雌激素受體的功能失調(diào)可能與lncRNAs LINC00993有關(guān)[28]。研究表明，lncRNAs肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1與TNBC的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，并可作為TNBC的潛在預(yù)后標(biāo)志物[29]。Liu等[30]通過整合miRNAs和lncRNAs信息，創(chuàng)新性地將TNBC分為四類，即免疫調(diào)節(jié)型、腔面雄激素受體型、間質(zhì)型和底樣及免疫抑制型。這種分型方法與Lehmann和Pietenpol[31]的分型部分相同，其中免疫抑制型侵襲性最強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺癌和其他癌癥的lncRNAs中，低甲基化發(fā)生率更高，lncRNAs EpIC1(epigenetically-induced lncRNA1)的低甲基化可上調(diào)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，而EpIC1過表達(dá)與患者的不良生存結(jié)局獨(dú)立相關(guān)，特別是基底樣亞型B乳腺癌，基底樣亞型B乳腺癌通過與MYC直接作用增加MYC靶基因的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程等，促進(jìn)腫瘤生成[32]。

3.2miRNAs與TNBC miRNAs在腫瘤中有兩種作用形式，分別發(fā)揮抑制和促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，抑制腫瘤的miRNAs包括miR-200家族、miR-205家族和let-7家族等，促進(jìn)腫瘤的miRNAs包括miR-155及miR-21等，因此miRNAs也是潛在的TNBC生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b、miR-26a、miR-146a和miR-153在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平與BRCA1相關(guān)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，BRCA1的表達(dá)水平被miR-10b和miR-26a下調(diào)，miR-146a在TNBC中顯著過表達(dá)但并不影響B(tài)RCA1的表達(dá)，而miR-153可以上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中BRCA1的表達(dá)[33]。然而，Kumaraswamy等[34]的研究顯示，BRCA1的表達(dá)與miR-146a呈正相關(guān)，與HER2呈負(fù)相關(guān)。此外，Garcia等[35]報(bào)道，miR-146a和miR-146b-5p可下調(diào)TNBC中BRCA1的表達(dá)。Murria等[36]研究發(fā)現(xiàn)，miR-590-5p和miR-4417在TNBC中高表達(dá)，miR-590可以通過與雌激素受體的兩個(gè)信使RNA序列相互作用影響雌激素受體調(diào)控，而miR-4417可以調(diào)控BRCA1信使RNA。Gasparini等[37]在TNBC中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)miRNAs組合，可以將患者分為高危組和低危組，其中miR-493和miR-155上調(diào)與患者預(yù)后良好相關(guān)，而miR-30a和miR-27a下調(diào)與患者預(yù)后不良相關(guān)。

另外，miRNAs也是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的驅(qū)動(dòng)因子，這是啟動(dòng)TNBC轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要過程。miR-200家族通過靶向EMT過程中的兩個(gè)關(guān)鍵基因[鋅指E盒結(jié)合同源框(zinc finger E-box-binding homeobox，ZEB)1和ZEB2]逆向調(diào)控腫瘤的EMT過程[37]。miR-200c、miR-141位點(diǎn)甲基化與TNBC中miR-200c的低表達(dá)及淋巴結(jié)浸潤(rùn)有關(guān)，有利于腦轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響TNBC患者的預(yù)后[38]。在小鼠乳腺癌異體移植模型中，miR-200b通過抑制蛋白激酶Cα抑制TNBC轉(zhuǎn)移；miR-200a還可通過調(diào)控磷酸化上皮細(xì)胞激酶2基因的表達(dá)調(diào)節(jié)TNBC遷移；而miR-200b-3p和miR-429-5p過表達(dá)通過抑制LIM激酶1/絲切蛋白1通路抑制TNBC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[39]，為TNBC的靶向治療開辟了新視野。

近年，有學(xué)者將血液中的外泌體miRNAs作為診斷和評(píng)估癌癥患者預(yù)后的新型標(biāo)志物[40]。外泌體含有大量的分子，如細(xì)胞類型特異性蛋白、脂質(zhì)、信使RNA和豐富的miRNAs等。Meng等[40]發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中的外泌體miRNAs水平更高，其中miR-10a、miR-10b、miR-21、miR-27a、miR-155、miR-373均顯著上調(diào)；在小鼠模型中，MCF-10A細(xì)胞經(jīng)MDA-MB-231細(xì)胞外泌體或乳腺癌患者來(lái)源外泌體處理后導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[37]。Wei等[41]報(bào)道，MCF-7來(lái)源的外泌體可以呈劑量依賴性地促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖，外泌體miR-128特異性地通過靶向Bax基因增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的增殖。Wang等[42]發(fā)現(xiàn)，與非侵襲性MCF-7細(xì)胞釋放的外泌體相比，高侵襲性MDA-MB-231細(xì)胞釋放的外泌體可以刺激受體細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。

4 染色質(zhì)重構(gòu)與TNBC

染色質(zhì)重構(gòu)是指通過修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控基因表達(dá)允許或限制轉(zhuǎn)錄，其可以通過對(duì)組蛋白或非編碼RNAs的轉(zhuǎn)錄后修飾以及對(duì)多梳抑制復(fù)合物2的招募或通過ATP依賴的染色質(zhì)重構(gòu)蛋白復(fù)合體來(lái)實(shí)現(xiàn)。SWI(mating-type switching)/SNF(sucrose fermentation)是與染色體重構(gòu)相關(guān)的最常見的復(fù)合體之一。SWI/SNF的兩種ATP酶BRG1(brahma-related gene 1)和BRM(brahma)在乳腺癌中的水平均升高，其中BRG1在TNBC細(xì)胞系中的下調(diào)導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤形成減少，體外細(xì)胞增殖減少，而敲除BRG1導(dǎo)致TNBC細(xì)胞株對(duì)阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、順鉑、環(huán)磷酰胺和紫杉醇的靈敏度增加[43]。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)了亞型特異性組蛋白修飾譜，包括TNBC細(xì)胞系中獨(dú)特的H3K36me3模式[44]。另一個(gè)特異性TNBC染色質(zhì)狀態(tài)是肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1，其標(biāo)記為H3K4me3和H3K79me2的活性修飾。有報(bào)道顯示，肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1與TNBC無(wú)關(guān)，但其在食管腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、結(jié)直腸癌等其他癌癥中高表達(dá)并預(yù)示預(yù)后不良；同時(shí)，肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1也可能通過EMT促進(jìn)腫瘤的侵襲[6]。在MDA-MB-231和HCC1937細(xì)胞中，小干擾RNA介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1缺失可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和集落形成減少[44]。

5 小 結(jié)

TNBC因具有獨(dú)特的臨床病理和分子特征而備受關(guān)注。目前，化療仍是TNBC患者唯一有效的治療方法。由于TNBC患者表現(xiàn)出不同的治療反應(yīng)和預(yù)后，TNBC患者的個(gè)體化治療和預(yù)后分析較困難，尤其是當(dāng)TNBC患者的診治取決于常規(guī)的臨床和病理特征(包括組織學(xué)分級(jí)、原發(fā)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及雌激素受體/孕激素受體/HER2表達(dá))時(shí)。分子分型破譯了不同亞型TNBC的特征，是實(shí)現(xiàn)靶向治療目的和(或)分層的必要前提。隨著靶向治療的出現(xiàn)，篩選更可靠的分子標(biāo)志物迫在眉睫，而全面了解調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的表觀遺傳學(xué)，有助于建立準(zhǔn)確的TNBC分子分型和有效的治療方案。