馮俊杰，蔣海強(qiáng)，董梅月，蔣安琪，王小明

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355）

蘿卜（Raphanus sativus L.）屬十字花科植物，它的多個(gè)部位都具有藥用價(jià)值［1］，但是只有其干燥成熟的種子被列入中華人民共和國藥典［2］，名為萊菔子（Semen Raphani）。萊菔子常用于消食、消腫、降氣、化痰，臨床上與常其它中藥結(jié)合用于治療食物消化不良、上腹部脹痛、便秘、腹瀉痢疾、氣喘、咳嗽痰瘀等［1-3］。研究表明，萊菔子中含有的不同種類化學(xué)成分是萊菔子發(fā)揮中藥活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。萊菔子炒制品多為藥用，“殺酶保苷”使其含有豐富的硫苷類化合物和芥子酸苷類化合物［4］。萊菔子的主要特征性化學(xué)成分為天然硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷，又名芥子油苷），此外還含有生物堿類、揮發(fā)油和脂肪酸類、黃酮類、多糖、酚酸類和蛋白質(zhì)類［5］。硫苷屬于十字花科植物的一種含硫次生代謝產(chǎn)物，是飲食中抗癌化合物的前體，可以在酶催化、熱反應(yīng)或者化學(xué)反應(yīng)等途徑下產(chǎn)生降解產(chǎn)物異硫代氰酸鹽、硫代氰酸鹽、腈類化合物或異硫氰酸酯等［6-8］。芥子堿作為萊菔子生物堿類最主要的成分，以芥子堿硫氰酸鹽的形式存在，是一種廣泛存在于十字花科植物中的季胺型生物堿，具有廣泛的藥理作用［9-10］。鉤藤總生物堿和萊菔子可溶性生物堿可以聯(lián)合應(yīng)用于N’-硝基-L-精氨酸誘導(dǎo)的高血壓大鼠的治療，具有良好的降壓作用和內(nèi)皮保護(hù)作用［11］。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于定性分析、靶向定量分析和質(zhì)量控制，可以通過分離化合物、檢測并捕獲其結(jié)構(gòu)信息實(shí)現(xiàn)復(fù)雜中藥成分原型及代謝物的鑒定［12-14］。超高效液相色譜（UPLC）具有快速分離化合物的能力，高分辨質(zhì)譜（HRMS）具有選擇性好、靈敏度高、質(zhì)量精確度好、專屬檢測能力強(qiáng)等特點(diǎn)，UPLC-HRMS聯(lián)合使用［15-17］，可產(chǎn)生用于輔助結(jié)構(gòu)推測的二級質(zhì)譜信息（包括前體離子和碎片離子）。在UPLC-Q-Orbitrap-MS中，四極桿對母離子具有高選擇性，軌道離子阱（Orbitrap）對精確質(zhì)量數(shù)具有高分辨性，樣品的基質(zhì)效應(yīng)小，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜中藥或生物樣品成分的定性和定量分析［17-18］。筆者應(yīng)用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對萊菔子的化學(xué)成分進(jìn)行分析，采用數(shù)據(jù)挖掘策略系統(tǒng)鑒定，初步鑒定出包括硫苷類、阿魏酰類、芥子酰類、黃酮類等多個(gè)類別在內(nèi)的70個(gè)化學(xué)成分。該實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為闡明萊菔子的化學(xué)成分提供了科學(xué)依據(jù)，從而為萊菔子的深入研究和進(jìn)一步開發(fā)利用奠定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜系統(tǒng)-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Fisher Ultimate 3000型及Q Exactive型，美國賽默飛世爾科技公司。

質(zhì)譜工作站：Xcalibur 3.0型，美國賽默飛世爾科技公司。

電子分析天平：CP225D型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

超聲清洗器：KQ-250E型，昆山市超聲儀器有限公司。

漩渦混勻器：MX-S型，美國賽洛捷克公司。

恒溫混勻儀：MSC-100型，杭州奧盛儀器有限公司。

臺式離心機(jī)：Heraeus Biofuge Primo R型，美國賽默飛世爾科技公司。

粉碎機(jī)：DFY-1000C型，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：300型，瑞士布奇公司。

萊菔子：批號為No.181020，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周洪雷教授鑒定為蘿卜的干燥成熟種子，標(biāo)本存放于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，編號為2018LFZ01。

甲醇、甲酸、乙腈：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

無水乙醇：吉林省新天龍實(shí)業(yè)股份有限公司。

石油醚：上海滬試化工有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水：蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

芥子堿標(biāo)準(zhǔn)品：經(jīng)HPLC面積歸一化法測定純度大于98%，成都克洛瑪生物科技有限公司。

3-丁烯基硫代葡萄糖苷、2-羥基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、3-（甲基亞磺酰基）丙基硫代葡萄糖苷、萊菔苷、2-苯乙基硫代葡萄糖苷、金蓮葡萄糖硫苷、吲哚甲基硫代葡萄糖苷、4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、芥子酸甲酯、芥子酸、E-芥子酸龍膽二糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：經(jīng)HPLC面積歸一化法測定，純度均大于98%，德國PhytoLab公司。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品芥子堿、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、2-羥基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、3-（甲基亞磺?；┍虼咸烟擒铡⑷R菔苷、2-苯乙基硫代葡萄糖苷、金蓮葡萄糖硫苷、吲哚甲基硫代葡萄糖苷、4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、芥子酸甲酯、芥子酸、E-芥子酸龍膽二糖苷適量，用70%甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度均為0.50 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL得到混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.04 mg／mL），以 12 000 r／min離心 10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

樣品溶液：稱取500 g萊菔子適當(dāng)粉碎，加入1 500 mL石油醚，脫脂3次，以2 000 mL的70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，過濾后合并提取液，減壓回收乙醇至提取物呈浸膏狀，濃縮，水浴蒸干，真空冷凍干燥后得到凍干狀提取物，計(jì)算得率為12.30%。精密稱取萊菔子提取物0.1 g，以70%甲醇-水超聲溶解，渦旋、振蕩并以12 000 r／min離心10 min，配制成提取物質(zhì)量濃度為20 mg／mL的樣品溶液，用于UPLC-Q-Orbitrap-MS分析。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色 譜 柱：ACQUITY UPLC?HSS T3色 譜 柱［100 mm×2.1 mm，1.8 μm，沃特世科技（上海）有限公司］；柱溫：40 ℃；流量：0.3 mL／min；流動(dòng)相：0.05%甲酸溶液（A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫：0～3 min為 0%B，3～8 min為 0～5%B，8～10 min為5%B，10～15 min為5%～15%B，15～17 min為 15%B，17～24 min為 15%～30%B，24～28 min為30%～70%B，28%～30 min為70%～100%B，30～35 min為100%B，35～35.1 min為100%～0%B，35.1～40 min為 0%B ；進(jìn)樣體積：3 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）：正、負(fù)離子模式；鞘氣：13.5 L／min；輔助氣流量：3 L／min；噴霧電壓：3 kV；毛細(xì)管溫度：350 ℃；輔助氣溫度：350 ℃；碰撞 能 量：20、40、60 eV；檢 測 方 式：Full MS／dd-MS2（Full MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500）；質(zhì)量掃描范圍：m/z 80～1 200；S-Lens RF Level：55。

1.4 成分分析與鑒定

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS分別在正、負(fù)離子模式下檢測、采集數(shù)據(jù)，得到總離子流圖。首先，檢索TCMSP （https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，并在Pubmed及CNKI查閱相關(guān)的國內(nèi)外文獻(xiàn)，整理萊菔子及其種屬的已知化學(xué)成分，然后將化合物導(dǎo)入Pubchem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)信息，最終構(gòu)建了萊菔子的成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。采用Xcalibur 3.0軟件，根據(jù)各成分的元素組成計(jì)算精確質(zhì)量數(shù)，結(jié)合分子離子、碎片離子信息，分析標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜裂解規(guī)律并比對相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道從而鑒定化學(xué)成分。首先通過一級MS確定準(zhǔn)分子離子峰，再通過Xcalibur 3.0質(zhì)譜工作站中的化學(xué)式預(yù)測功能，預(yù)測出化學(xué)式；再根據(jù)MS2裂解碎片信息，進(jìn)行相關(guān)基團(tuán)和母核結(jié)構(gòu)的推導(dǎo)，總結(jié)出特征碎片離子；最后參照萊菔子提取物所含成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律對結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測和指認(rèn)。采用Compound Discoverer 3.1軟件并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫mzCloud（https://www.mzcloud.org/）、Chemspider （http://www.chemspider.com/）等，合理設(shè)計(jì)軟件工作流程，對質(zhì)譜檢測到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行智能處理，獲取成分精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、二級碎片離子信息，對化合物進(jìn)行輔助確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理

根據(jù)樣品的極性大小，分別選擇水、70%甲醇-水、甲醇分別作為提取溶劑超聲提取。通過比較提取樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與水、甲醇相比，70%甲醇-水提取出樣品的總離子流圖中色譜峰形與響應(yīng)值更好，有效成分峰更多。因此選擇70%甲醇-水作為提取溶劑。

2.1.2 洗脫溶劑與洗脫梯度

在流動(dòng)相中加入適量的甲酸可以促進(jìn)化學(xué)成分的電離，從而有利于離子響應(yīng)值的提高。分別用0.05%、0.1%和0.2%甲酸溶液考察溶劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以上比例甲酸溶液對色譜峰形與響應(yīng)值沒有顯著影響，最終選擇0.05%甲酸溶液作為流動(dòng)相。首先，將流動(dòng)相0.05%甲酸水溶液（A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B）設(shè)定洗脫梯度為0～5 min、0%B ；5～35 min、0%～100%B ；35～40 min、100%B。之后根據(jù)采集到的總離子流圖調(diào)整流動(dòng)相比例，發(fā)現(xiàn)在某些時(shí)間段內(nèi)出峰緊密且各色譜峰并未分開，則適當(dāng)延長此段時(shí)間；在某些時(shí)間段內(nèi)出峰極少或者不出峰，則適當(dāng)縮短此段時(shí)間。最終優(yōu)化的流動(dòng)相洗脫梯度見1.3.1。

2.1.3 碰撞能量

逐級將碰撞能量分別設(shè)定為10、20、30 eV和25、45、65 eV。據(jù)所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)低碰撞能量時(shí)碎片離子信息較少，故需要提高碰撞能量；高碰撞能量時(shí)分子離子峰強(qiáng)度極弱或幾乎沒有，需要降低碰撞能量。最終確定碰撞能量為20、40、60 eV。

2.2 萊菔子70%乙醇提取物的化學(xué)成分分析

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS 技術(shù)分析萊菔子標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液的化學(xué)成分，混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖見圖1、圖2。70%乙醇提取物的總離子流圖見圖3、圖4。主要鑒定信息見表1。

表1 LC-MS鑒定萊菔子中的化學(xué)成分

圖1 正離子模式下萊菔子混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式下混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖

圖3 正離子模式下萊菔子70%乙醇提取物的總離子流圖；

圖4 負(fù)離子模式下70%乙醇提取物的總離子流圖

續(xù)表1

下面以硫代葡萄糖苷及其降解產(chǎn)物和生物堿類化合物為例，結(jié)合建立的數(shù)據(jù)挖掘策略，對萊菔子70%乙醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，并進(jìn)行未知化合物的初步鑒定，以說明該策略的可行性。

2.2.1 硫代葡萄糖苷及其降解產(chǎn)物

硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷，別名芥子油苷）是雙子葉植物組織中的一類次生代謝產(chǎn)物，但是目前其特殊的功能尚未見報(bào)道。然而，這些物質(zhì)可以在植物中轉(zhuǎn)化為其它具有較高生物活性的化合物形式，如異硫氰酸鹽、硫氰酸鹽和腈［1］。蘿卜硫苷是一種硫代葡萄糖苷，是一種有效的抗癌藥物蘿卜硫素（又稱萊菔硫烷）的前體。歸屬于異硫氰酸鹽類的蘿卜硫素和萊菔素分別來自于硫苷中的蘿卜硫苷和萊菔苷［19-21］。攝入蘿卜等其它富含天然膳食化合物的食物可以延緩或預(yù)防人類癌癥的發(fā)生，這種保護(hù)作用與異硫氰酸鹽類物質(zhì)有尤為重要的關(guān)系［21］，異硫氰酸鹽是芥子油苷的一種水解產(chǎn)物，在十字花科中相對獨(dú)特。它們的生成過程如圖5所示。

圖5 酶解硫代葡萄糖苷的異硫氰酸鹽途徑

脂肪族硫苷、芳香族硫苷和吲哚族硫苷是硫代葡萄糖苷的常見類型，它們化學(xué)結(jié)構(gòu)的相同位置含有1個(gè)β-D-葡萄糖和1個(gè)磺酸肟基團(tuán)，不同之處來自于氨基酸的側(cè)鏈。首先以蘿卜硫苷和蘿卜硫素為例，根據(jù)UPLC-Q-Orbitrap-MS采集出的總離子流圖和各色譜保留時(shí)間對應(yīng)成分的質(zhì)譜圖，推測硫代葡萄糖苷及其降解產(chǎn)物的裂解途徑。對于保留時(shí)間為2.59 min的化合物，其負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 436.0411，預(yù)測化學(xué)式為C12H23NO10S3，質(zhì)量數(shù)誤差為2.536×10-6。相關(guān)文獻(xiàn)表明［21-23］，硫苷的特征碎片離子包括 m/z 275、259、241、195、96、75，以及失去 GLC、SO3-基團(tuán)［M-H-242］-的碎片離子m/z 192，此外利用m/z 259和m/z 97碎片離子可有效的進(jìn)行初步篩選，用于確定植物提取物中硫苷的存在。根據(jù)二級質(zhì)譜圖（見圖 6）中的碎片離子 m/z 274.980 1、259.012 5、195.033 0、96.958 5、74.989 3，推測蘿卜硫苷可能的裂解規(guī)律如圖7～圖10所示。

圖6 蘿卜硫苷的質(zhì)譜圖

圖7 蘿卜硫苷可能的裂解規(guī)律1

圖8 蘿卜硫苷可能的裂解規(guī)律2

圖9 蘿卜硫苷可能的裂解規(guī)律3

圖10 蘿卜硫苷可能的裂解規(guī)律4

蘿卜硫苷的降解產(chǎn)物蘿卜硫素會丟失1分子甲基亞磺?；?，產(chǎn)生碎片離子m/z 114.037 2，根據(jù)二級質(zhì)譜圖（見圖11）所示，正離子模式下產(chǎn)生分子離子峰為m/z 178.035 3，預(yù)測分子式為C6H11NOS2，保留時(shí)間為19.75 min，質(zhì)量數(shù)誤差為-0.966×10-6，其裂解規(guī)律如圖12所示。據(jù)此推測異硫氰酸鹽類可能丟失甲基亞磺?；?，產(chǎn)生［M+H-64］+的特征碎片離子。

圖11 蘿卜硫素的二級質(zhì)譜圖

圖12 蘿卜硫素可能的裂解規(guī)律

根據(jù)硫苷特征碎片離子，分析負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子m/z 420.046 3，預(yù)測其化學(xué)式為 C12H23NO9S3，質(zhì)量數(shù)誤差為 2.881×10-6，產(chǎn)生碎片離子 m/z 274.990 7，259.103 4，96.958 4，74.989 3，經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)以及在線數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證，可以推測該化合物是4-甲基硫代丁基硫代葡萄糖苷，保留時(shí)間為12.94 min。

2.2.2 生物堿

萊菔子中主要含有水溶性生物堿，且多以硫氰酸鹽的形式存在［24］。其中芥子堿硫氰酸鹽具有降壓活性［25］，是萊菔子重要的藥效活性成分之一。因此以芥子堿硫氰酸鹽為例，分析其可能的裂解規(guī)律。正離子模式下，在一級質(zhì)譜圖中顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z 310.163 8，預(yù)測化學(xué)式為C16H24NO5+，二級質(zhì)譜圖13中，發(fā)現(xiàn)其特征性碎片離子為m/z 251.090 6，236.066 9，207.064 7，175.038 5，147.043 7，保留時(shí)間為19.98 min，質(zhì)量數(shù)誤差為-3.480×10-6，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)以及在線數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證，推測出芥子堿硫氰酸鹽可能的裂解途徑如圖14所示。

圖13 芥子堿硫氰酸鹽的二級質(zhì)譜圖

圖14 芥子堿硫氰酸鹽可能的裂解規(guī)律

2.2.3 未知化合物

未知成分可根據(jù)二級質(zhì)譜產(chǎn)生的特征碎片離子，結(jié)合數(shù)據(jù)庫信息和相關(guān)文獻(xiàn)，在已知成分的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上推測其所屬化合物類型以及具體的結(jié)構(gòu)信息。以保留時(shí)間為1.25 min的未知化合物1為例，負(fù)離子模式下，其二級質(zhì)譜圖（見圖15）顯示的碎片離子 m/z 259.013 2、96.958 4、74.989 3，與 2.2.1 節(jié)中硫苷裂解的特征碎片離子吻合，且m/z 259、97離子可用于確定植物提取物中硫苷的存在［21-23］，故推測該化合物為硫苷類成分。一級質(zhì)譜圖中顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 406.048 3，預(yù)測化學(xué)式為C11H21NO11S2，質(zhì)量數(shù)誤差為2.590×10-6。在標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖中，質(zhì)譜圖顯示一化合物分子式為C11H19NO10S2，m/z 388，結(jié)合硫苷特征性碎片離子，提示該化合物為2-羥基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷。未知化合物1與其相對分子質(zhì)量相差18 Da，猜測未知化合物1可能會脫去1分子H2O形成2-羥基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，從而推測其化學(xué)結(jié)構(gòu)，推測出的結(jié)構(gòu)經(jīng)由SciFinder查找確認(rèn)為未知，該未知化合物可能的裂解規(guī)律如圖16所示。

圖15 未知化合物1的質(zhì)譜圖

圖16 未知化合物1可能的裂解規(guī)律

3 結(jié)語

萊菔子為藥食同源類中藥材，在全國各地均有生產(chǎn)，具有抗癌、抗氧化、降壓等多種藥理作用，有著廣闊的應(yīng)用前景，其中的主要活性化合物是生物堿、硫苷和黃酮類化合物，但目前萊菔子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多以芥子堿硫氰酸鹽為指標(biāo)［1，28］。筆者采用UPLCQ-Orbitrap-MS技術(shù)對萊菔子的化學(xué)成分進(jìn)行初步分析鑒定，結(jié)果表明，萊菔子中主要包括硫苷類及其降解產(chǎn)物、芥子堿、黃酮、芥子酰及阿魏酰類化合物、有機(jī)酸、芳香小分子，共鑒定出總計(jì)70種化學(xué)成分，為萊菔子的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開發(fā)利用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，并為其藥理作用的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。