范菲，李靜靜，王喻，安慶，鄭妍

（西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710054）

人們生活水平越來(lái)越高，對(duì)美的追求也不斷提高，一些功能性化妝品應(yīng)運(yùn)而生。然而一些不良企業(yè)為了追求效果，不惜在化妝品中違禁添加藥物成分，對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成了極大的危害，因此化妝品的安全問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注。法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁為H2（Histamine H-2）受體阻斷劑，主要用來(lái)抑制胃酸分泌，同時(shí)還能抑制胃蛋白酶的分泌。臨床上主要用于治療十二指腸潰瘍、胃潰瘍、上消化道出血等疾病。近年來(lái)，隨著進(jìn)一步深入研究，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)皮膚血管中具有H1（Histamine H-1）和H2組胺受體，而西咪替丁是一種強(qiáng)效H2受體拮抗劑，故對(duì)許多皮膚疾病治療有效［1-2］。2019年，國(guó)家藥監(jiān)局將西咪替丁列為了化妝品中主要檢測(cè)物質(zhì)之一，公布了其檢測(cè)方法，由于法莫替丁和雷尼替丁與西咪替丁功能相似，不良企業(yè)可能將西咪替丁替換為法莫替丁或雷尼替丁。文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)中藥及保健食品中非法添加法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁的檢測(cè)較多［3-15］，但未見(jiàn)同時(shí)檢測(cè)測(cè)定化妝品中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁含量方法，因此筆者建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁含量方法，為法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁質(zhì)量控制提供較為可靠的實(shí)驗(yàn)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：ULTIMATE U-3000型，配備二極管陣列檢測(cè)器（DAD），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

電子天平：BSA124S-CW型，感量為1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MS105型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司。

法莫替丁對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.2%，批號(hào)為100305-201003，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

雷尼替丁對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.8%，批號(hào)為100163-201006，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

西咪替丁對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.8%，批號(hào)為100158-201105，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

化妝品樣品：爽膚水、乳液、霜，市售。

甲醇、乙腈：色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

實(shí)驗(yàn)用其它試劑均為分析純。

磷酸二氫鉀溶液：0.05 mol／L，稱(chēng)取磷酸二氫鉀6.8 g，加水1 000 mL溶解，用氨水調(diào)pH值至7.0。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Thermo scientific AcclaimTM120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液；梯度洗脫程序：0～25 min為10%的流動(dòng)相 A，25～30 min為 10%～90% 的A，30～35 min為90%的流動(dòng)相A，35～36 min為90%～10%的流動(dòng)相A，36～42 min為10%的流動(dòng)相A；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm；柱溫：30 ℃；流量：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 溶液的配制

樣品溶液：稱(chēng)取樣品（化妝品：爽膚水、乳液、霜）0.5 g于25 mL比色管中，加20 mL甲醇，在渦旋混勻器上高速振蕩30 s，使樣品與提取溶劑充分混勻。然后超聲提取20 min，靜置至室溫，加甲醇定容至標(biāo)線并搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液作為樣品溶液。

混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：分別精密稱(chēng)取法莫替丁對(duì)照品19.87 mg、雷尼替丁對(duì)照品21.02 mg、西咪替丁對(duì)照品21.03 mg置于同一50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得法莫替丁、雷尼替丁、西咪替丁的質(zhì)量濃度分別為394.22、419.56、419.76 mg／mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別用甲醇稀釋2 500、500、200、50、20、10、5倍，配制成的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液列于表1。

表1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度 mg／mL

陰性對(duì)照品溶液：取已確定未添加法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁的化妝品樣品0.5 g作為陰性樣品，按照樣品溶液的配制方法，配制成陰性對(duì)照品溶液。

陰性對(duì)照品加標(biāo)溶液：取陰性樣品0.5 g，添加混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，按照樣品溶液的配制方法，配制成陰性對(duì)照品加標(biāo)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

由于化妝品成分較為復(fù)雜，等度洗脫難以充分分離，故采用梯度洗脫方法。參考國(guó)家藥監(jiān)局關(guān)于發(fā)布化妝品中西咪替丁檢測(cè)方法的通告（2019年第 48 號(hào)）、中國(guó)藥典［16］和相關(guān)文獻(xiàn)資料［11-15］，考察了十八烷基鍵合硅膠柱包括Thermo scientific AcclaimTM120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，賽默飛世爾科技公司）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm×4.6 mm，4 μm，安捷倫科技有限公司）、SPOLAR C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，資生堂公司）、CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，資生堂公司）、Sepax BR-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，賽分科技有限公司）和Agilent Eelipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，4 μm，安捷倫科技有限公司），對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)包括乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液分別進(jìn)行考察實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，長(zhǎng)度為250 mm的色譜柱分離效果優(yōu)于150 mm的色譜柱，不同品牌的250 mm的C18色譜柱均能很好分離法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁，說(shuō)明此方法色譜柱耐受性強(qiáng)；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液系統(tǒng)時(shí)，各組分峰型及分離度良好，未見(jiàn)其它成分干擾，最終選擇Thermo scientific AcclaimTM120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)藥品法典［16］以及文獻(xiàn)資料［3，10］，使用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁進(jìn)行200～400 nm全波長(zhǎng)掃描，紫外光譜圖見(jiàn)圖1～圖3，發(fā)現(xiàn)法莫替丁最大吸收波長(zhǎng)為205、284 nm，雷尼替丁最大吸收波長(zhǎng)為226、317 nm，西咪替丁最大吸收波長(zhǎng)為216 nm，對(duì)比不同波長(zhǎng)色譜圖，綜合各組分吸收情況，表明226 nm波長(zhǎng)條件下，各組分的吸收值均較大，且無(wú)雜質(zhì)干擾，故選擇226 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 法莫替丁紫外光譜圖

圖2 雷尼替丁紫外光譜圖

圖3 西咪替丁紫外光譜圖

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密量取陰性對(duì)照溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照加標(biāo)溶液，按1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖4～圖6，法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁保留時(shí)間分別為 11.939、16.558、20.440 min，與相鄰雜質(zhì)峰分離度大于7.28，色譜峰形良好。

圖4 陰性對(duì)照品溶液色譜圖

圖5 混合對(duì)照品溶液色譜圖

圖6 陰性對(duì)照品加標(biāo)色譜圖

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液，按1.2項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定樣品溶液峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.3%，表明法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 線性方程、檢出限與定量限

精密量取系列混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜數(shù)據(jù)。以各組分的質(zhì)量濃度（x）對(duì)峰面積（y）進(jìn)行線性回歸處理，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)?倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），以10倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ）。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表3。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取陰性對(duì)照0.5 g置于25 mL比色管中，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液高、中、低三個(gè)水平各3份，按1.3制備樣品溶液，按1.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，3個(gè)濃度組間的法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁平均回收率為94.63%～102.09%，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

續(xù)表4

2.6 精密度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取法莫替丁16.12 mg、雷尼替丁16.95 mg和西咪替丁16.98 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解至標(biāo)線，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液，再精密稱(chēng)取爽膚水、乳液、霜類(lèi)樣品各5 g，分別加入混合對(duì)照品溶液4 mL，混勻，各取5份，按1.3制備樣品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，爽膚水中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.88%、0.74%、0.76%，乳液中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.74%、0.40%、0.52%，霜中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.75%、0.49%、0.34%，表明該方法的精密度良好。

3 結(jié)語(yǔ)

建立梯度洗脫高效液相色譜法同時(shí)分析化妝品中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁含量的方法。該方法簡(jiǎn)便、快速，專(zhuān)屬性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于化妝品中法莫替丁、雷尼替丁和西咪替丁的檢測(cè)，為化妝品質(zhì)量控制提供可靠方法和參考依據(jù)。