吳思菲 宋杰 陳宗波

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，山東 青島 266003)

腸病毒71型(EV71)是一種無包膜、單鏈RNA病毒，它屬于人腸道病毒A組。EV71可引起手足口病、無菌性腦膜炎、急性腦干腦炎等多種疾病，是嬰幼兒手足口病重癥感染的主要病原體之一[1-3]。EV71已成為一種神經(jīng)元侵襲性病毒，在亞太地區(qū)多次爆發(fā)。2008-2012年，我國出現(xiàn)EV71手足口病大爆發(fā)，發(fā)病數(shù)超700萬例，死亡2 457例[4]。EV71重癥感染致殘率和病死率均較高，而發(fā)病機(jī)制尚未明確。其感染與宿主易感性、病毒毒力、生活環(huán)境等多種因素有關(guān)。從宿主基因水平探討EV71感染的易感性與嚴(yán)重性是目前研究的主要方向之一。白介素17F(IL-17F)是由Th17細(xì)胞分泌的一種炎性因子，它可以誘導(dǎo)多種促炎因子和趨化因子的產(chǎn)生[5]。IL-17F基因與IL-17基因位于同一染色體區(qū)，二者有50%的同源性[6]。IL-17F在多種感染性疾病及自身免疫性疾病中起重要作用，如慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性腎臟疾病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[7-9]。已有研究表明IL-17F基因1507位點(diǎn)多態(tài)性與病毒感染有關(guān)，但目前IL-17F基因1507位點(diǎn)多態(tài)性如何參與EV71感染尚不清楚，為了明確EV71易感人群及避免EV71重癥感染帶來的危害，本研究旨在探討IL-17F基因1507位點(diǎn)多態(tài)性與兒童EV71感染嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1

以2014年6月—2018年6月就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院和青島市婦女兒童醫(yī)院EV71病毒核酸檢測陽性的360例患兒為感染組，其中男189例，女171例；年齡(4.02±1.76)歲。根據(jù)中國衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病診療指南(2010年版)》中的標(biāo)準(zhǔn)[10]，將感染組分為輕癥組233例和重癥組127例。兩組兒童年齡、性別等一般資料比較差異無顯著性。以同時(shí)期就診于上述兩所醫(yī)院的350例健康查體兒童為對(duì)照組，男183例，女167例；年齡(5.03±2.12)歲。對(duì)照組兒童EV71病毒核酸檢測均為陰性，且咽拭子、糞便等標(biāo)本中無EV71，并除外其他感染、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的兒童。

1.2

采用上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司開發(fā)的多重連接檢測反應(yīng)技術(shù)檢測IL-17F基因1507位點(diǎn)的多態(tài)性。PCR反應(yīng)引物，正向：5′-GAGGGAGGACCCTTCCTGA-3′，反向：3′-GCCCACCTTTTCTCCCCAAG-5′。PCR條件：①95 ℃ 2 min，循環(huán)1次；②94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)11次；③94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)24次；④72 ℃ 2 min，循環(huán)1次。將1 μL堿性磷酸酶加入PCR產(chǎn)物中，并在75 ℃條件下滅活15 min。雙連接反應(yīng)：95 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min，循環(huán)38次；置于4 ℃下保存。最后采用GeenMapper 4.0(Applied Bio system，美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組間基因型以及等位基因分布的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1

感染組TT基因型頻率和T等位基因頻率均較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.399、6.722，P<0.05)。見表1。

表1 兩組IL-17F基因1507位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較

2.2

重癥組TT基因型頻率和T等位基因頻率均較輕癥組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.119、9.277，P<0.05)。見表2。

表2 重癥組和輕癥組IL-17F基因1507位點(diǎn)基因型和等位基因分布

3 討 論

EV71感染已經(jīng)在全世界多個(gè)國家和地區(qū)流行，其臨床表現(xiàn)輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為自限性手足口病或者皰疹性咽峽炎，重者則可能出現(xiàn)腦炎、急性遲緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫或肺出血，甚至心肺衰竭[11-13]。其中腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、心肺衰竭等并發(fā)癥是導(dǎo)致死亡的主要原因。EV71感染引起嚴(yán)重并發(fā)癥的機(jī)制尚未明確，其感染主要取決于病毒、宿主和環(huán)境等多重因素。目前已有多種研究表明細(xì)胞因子的基因多態(tài)性與EV71感染有關(guān)，其中LV等[14]發(fā)現(xiàn)IL-17F基因多態(tài)性與EV71腦炎相關(guān)，且IL-17F基因7488位點(diǎn)C等位基因?yàn)楦腥镜谋Ｗo(hù)因素。

IL-17家族是具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的新型細(xì)胞因子家族，其家族成員在炎性疾病中起著積極作用。該家族包括6個(gè)成員的配體(IL-17A～I(xiàn)L-17F)和5個(gè)受體(IL-17RA～I(xiàn)L-17RE)[15]。IL-17A與IL-17F有58%的同源性，它們的細(xì)胞來源和功能也非常相似，且在連鎖基因上共同表達(dá)，通常由Th17細(xì)胞產(chǎn)生[16]。KAWAGUCHI等[17]研究發(fā)現(xiàn)IL-17F基因7488位點(diǎn)與激活靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子的能力低下有關(guān)，并對(duì)野生型IL-17F的炎癥作用可能具有保護(hù)性。已有研究證實(shí)，Th1、Th17以及細(xì)胞因子IL-17A、IL-6等均與EV71感染發(fā)病機(jī)制有關(guān)[18-20]。由于IL-17F和IL-17A存在同源性，并且IL-17F基因1507位點(diǎn)的多態(tài)性與多種免疫性及炎性疾病有關(guān)。基于上述機(jī)制，本次主要研究IL-17F基因1507位點(diǎn)多態(tài)性與EV71嚴(yán)重感染的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，感染組TT基因型和等位基因T頻率較對(duì)照組高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重癥組中TT基因型頻率較輕癥組高出約2倍，其T等位基因頻率也較輕癥組高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示IL-17F基因1507位點(diǎn)基因型TT及等位基因T與EV71感染相關(guān)，尤其是EV71重癥感染,這與之前有關(guān)報(bào)道的結(jié)果一致[21]。

本研究存在幾點(diǎn)不足：第一，由于各組樣本量少，且研究對(duì)象局限于青島地區(qū)，可能存在地域差異；第二，未探討IL-17F基因多態(tài)性在EV71感染過程中的調(diào)控機(jī)制。