鄭曉華 董銳 白晶 趙宇

（黑龍江省疾病預(yù)防控制中心，黑龍江 哈爾濱，150030）

1.病原微生物檢測中的常見分子生物學(xué)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在生命科學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價值，它是一種常見的分子生物學(xué)技術(shù)。它能在體外以體外酶的作用，促進(jìn)DNA片段的合成，在合成之后，通過DNA雙鏈的延伸，退火變性等一系列的流程，然后是DNA片段，得到快速擴(kuò)張，擴(kuò)增之后能達(dá)到更好的檢測效果，PCR技術(shù)簡而言之，就是利用DNA片段在高溫環(huán)境下會變性，恢復(fù)常溫會再次形成雙鏈的特點(diǎn)，進(jìn)行檢測的技術(shù)在體外95攝氏度的溫度下變成單鏈，在60度左右的溫度下，又會根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理形成雙鏈，75攝氏度的環(huán)境下是DNA聚合酶的最佳溫度，在DNA聚合酶的作用下，它能沿著磷酸的方向轉(zhuǎn)為戊糖(5’-3’)[1]。聚合酶鏈反應(yīng)儀實(shí)際上是一種溫控設(shè)備，可以很好地將溫度控制在95℃、55℃和72℃之間。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀有單通道、雙通道和多通道，因為單通道一次只能檢測一個目標(biāo)基因的擴(kuò)增量，需要多次擴(kuò)增才能檢測不同目標(biāo)基因片段的量。它廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物實(shí)驗室，在類似于遺傳病圖譜檢測傳染病的診斷與檢測基因復(fù)制以及親子鑒定等方面，PCR技術(shù)都有非常廣泛的應(yīng)用，在病原微生物檢測中，PCR技術(shù)更是成為當(dāng)下最流行的一種檢測技術(shù)。

2.PCR技術(shù)在病原微生物檢測中的作用分析

2.1 研究方法

選取在我院就診的50例患者作為研究對象。首先選擇模擬樣本或已知數(shù)量值的臨床樣本進(jìn)行多次稀釋，每個濃度至少重復(fù)三次，這樣就能獲得最低濃度的陽性檢測樣本，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得R^2和擴(kuò)增效率的信息(一般標(biāo)準(zhǔn)曲線至少要有5個點(diǎn)，qPCR的r^2≥0.99，擴(kuò)增效率為90%-110%)。然后，在最低檢測濃度附近制備幾個濃度，并進(jìn)行20次重復(fù)。該方法的靈敏度/最小檢測限為19個以上陽性檢測的濃度。每名患者要采集兩份病原微生物檢測樣本，一號病原微生物檢測樣本是實(shí)驗組，它采用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢驗二號病原微生物為實(shí)驗組，它采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，通過兩組的對照與統(tǒng)計，能夠比較出兩組患者在病原微生物檢測中具體的滿意度和陽性率。

2.2 研究過程

在無菌環(huán)境下，將20種標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)板上，在合適的溫度下培養(yǎng)12-24小時。選擇單個菌落，接種在5ml液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。生物信息學(xué)方法用于篩選基因序列的保守片段。每種病原體設(shè)計有兩對引物，共有特異性引物，40對特異性整體片段長度在90 bp到100 bp之間，在實(shí)際的檢測中，每對引物對目標(biāo)的菌株基因組模板進(jìn)行首次PCR，PCR之后的產(chǎn)物，經(jīng)過電泳檢測，一般是在瓊脂糖凝膠檢測所擴(kuò)增的產(chǎn)物送到第三方檢測機(jī)構(gòu)，然后進(jìn)行DNA測序檢驗PCR引物的敏感性，整體上目標(biāo)菌株的特異性引物用以擴(kuò)增，引物的特異性通過聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物中非特異性條帶的存在來驗證。根據(jù)模板混合物中包含的目標(biāo)，選擇兩對相應(yīng)的引物在與陽性對照相同的條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，以確認(rèn)聚合酶鏈反應(yīng)是否可以正常進(jìn)行。通過聚合酶鏈反應(yīng)從目標(biāo)細(xì)菌的基因組中獲得目標(biāo)擴(kuò)增片段。5μl模板用于多重PCR擴(kuò)增，每個梯度重復(fù)3組[2]。

2.3 研究結(jié)果

與兩組患者的病原微生物檢測陽性計算率相比，在實(shí)驗組患者的病原微生物檢測整體的陽性概率為78%，這一數(shù)據(jù)與實(shí)驗組相比明顯更高一些，而兩組患者的病原微生物檢測滿意程度顯然是實(shí)驗組二更高，實(shí)驗組二的滿意率為94%，而實(shí)驗組的滿意率僅為78%。

與傳統(tǒng)的檢測方法相比，PCR有三個優(yōu)點(diǎn):首先，這種方式的操作相對簡單，檢測微生物時只需1-2小時即可完成檢測，它非常適合于快速檢測，且能提升整體的病原微生物檢測效率，在突發(fā)傳染性疾病檢測中具有優(yōu)勢檢測作用，另外PCR技術(shù)的特異性很高，在檢測病原微生物時可以準(zhǔn)確地檢測微生物的種類。最后，靈敏度高，可以達(dá)到3個rfu的靈敏度，因此在檢測病原微生物中作用是非常明顯的，在2020年新冠肺炎期間，PCR技術(shù)更是在核酸檢測中廣泛應(yīng)用，新冠病毒的結(jié)構(gòu)是由DNA或RNA與外部脂質(zhì)保護(hù)囊結(jié)合而成。PCR核酸檢測是直接從鼻腔取樣檢測新冠病毒的DNA。因此，直接檢測病毒DNA是最準(zhǔn)確、最快、最有效的新冠檢測方法。經(jīng)過多年的研究，PCR技術(shù)在豬病相關(guān)的疾病診斷和檢驗中已經(jīng)具有很高的特異性，且操作方便，易于臨床開展，最大程度上節(jié)省救治時間，降低救治風(fēng)險。

3.結(jié)語

總而言之，微生物病原體檢測中需要技術(shù)支持，在實(shí)際的應(yīng)用過程中，PCR技術(shù)是常見的且具有較高的應(yīng)用優(yōu)勢，基于此，更應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)技術(shù)做好相關(guān)的規(guī)范，才能提升研究效果。