丁祺，楊紅玉，常春，耿松珊，趙興楠

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1]，因?yàn)槁殉舶┰缙谌狈Φ湫偷呐R床癥狀以及特異性的篩查方法，多數(shù)患者在診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)展至中晚期，雖然通過細(xì)胞減滅術(shù)及放化療能夠清除病灶、延長(zhǎng)生存時(shí)間，但患者的整體預(yù)后情況并不理想。因此，尋找在卵巢癌診斷、預(yù)后評(píng)估中具有積極意義的生物標(biāo)志物是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也具有迫切的臨床需求。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種進(jìn)化上高度保守的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度18～25個(gè)核苷酸，主要在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控靶基因表達(dá)，進(jìn)而在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起促癌或抑癌作用。近些年，多種miRNAs被證實(shí)在卵巢癌患者外周血及病灶內(nèi)存在異常表達(dá)[2]。miR-204是一種具有抑癌作用的miRNA，卵巢癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是miR-204的靶基因，miR-204通過抑制Bcl-2、BDNF抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲[3-4]，但卵巢癌患者體內(nèi)miR-204的變化情況尚不明確。本研究分析卵巢癌患者外周血miR-204表達(dá)變化的臨床意義并在臨床樣本中驗(yàn)證miR-204靶向Bcl-2、BDNF的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年1月至2018年2月在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院診斷為卵巢癌的78例患者作為卵巢癌組，入組標(biāo)準(zhǔn)：① 經(jīng)病理診斷為卵巢癌；② 臨床病理資料完整；③ 隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 術(shù)前接受過放化療；② 既往有其他惡性腫瘤病史；③ 合并急慢性感染、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病。另取同期60例健康體檢女性作為對(duì)照組。本研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),研究對(duì)象知情同意。卵巢癌組年齡34～58歲、平均(42.73±7.92)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(22.93±9.28) kg/m2；對(duì)照組年齡33～55歲、平均(41.84±8.29)歲，BMI(22.72±9.92)kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 材料

血漿miRNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京天根公司；RIPA裂解液、蛋白定量試劑盒(BCA法)購(gòu)自上海碧云天公司，兔來源Bcl-2、BDNF一抗購(gòu)自Abcam公司；卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心；miR-204模擬物及陰性對(duì)照(NC)模擬物購(gòu)自上海吉瑪公司，Bcl-2、PTEN的雙熒光素酶報(bào)告基因及檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血miR-204表達(dá)的檢測(cè) 卵巢癌組患者術(shù)前抽取外周靜脈血3 mL，對(duì)照組志愿者體檢時(shí)抽取外周靜脈血3 mL，按照試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，提取miRNA后反轉(zhuǎn)錄合成為相應(yīng)的cDNA，配置熒光定量PCR反應(yīng)體系，分別使用目的基因miR-204及內(nèi)參基因U6，在熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到反應(yīng)的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，代入公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-204的表達(dá)量。

1.3.2 卵巢癌中Bcl-2、BDNF表達(dá)的檢測(cè) 取卵巢癌組織，加入RIPA裂解液并充分勻漿，勻漿液4℃、12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，分離上清液并采用BCA法檢測(cè)蛋白含量，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果、每個(gè)樣本取30 μg蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉、孵育一抗(Bcl-2、BDNF一抗1∶1 000稀釋，β-actin一抗1∶5 000稀釋)、孵育二抗，加入ECL顯影液、在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像，得到Bcl-2、BDNF、β-actin的條帶及灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算Bcl-2、BDNF的表達(dá)水平。

1.3.3 預(yù)后隨訪 采用電話回訪、門診復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，隨訪起始時(shí)間為術(shù)后第1天，截止時(shí)間為2019年10月31日。無進(jìn)展生存率(progression-free survival，PFS)為術(shù)后第1天起，至發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及其他原因引起死亡的時(shí)間；總生存率(overall survival，OS)為術(shù)后第1天起，至死亡的時(shí)間。

1.3.4 miR-204生物信息學(xué)分析 在targetscan網(wǎng)站http:∥www.targetscan.org/vert_72/中輸入“miR-204”后得到靶基因列表，根據(jù)列表中Bcl-2、BDNF的信息得到miR-204靶向Bcl-2、BDNF基因mRNA 3′UTR的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.3.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) SKOV3細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代后接種在24孔培養(yǎng)板內(nèi)，而后進(jìn)行分組：miR-NC組共轉(zhuǎn)染NC模擬物及雙熒光素酶報(bào)告基因，miR-204組轉(zhuǎn)染miR-204模擬物及雙熒光素酶報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染24h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲熒光值及海腎熒光值，計(jì)算螢火蟲熒光值/海腎熒光值作為報(bào)告基因的熒光活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR-204表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較(1.00±0.27)，卵巢癌組患者外周血miR-204的表達(dá)水平(0.58±0.19)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.191，P<0.001)。

2.2 卵巢癌組中不同臨床病理特征患者外周血miR-204表達(dá)水平比較

卵巢癌組中不同年齡、病理分級(jí)、組織類型患者外周血miR-204表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)IGO分期III～I(xiàn)V期患者外周血miR-204表達(dá)水平明顯低于I～I(xiàn)I期患者，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血miR-204表達(dá)水平明顯低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，CA125>200 U/mL患者外周血miR-204表達(dá)水平明顯低于CA125≤200 U/mL患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表1。

表1 卵巢癌組中不同臨床病理特征患者外周血miR-204表達(dá)水平比較

2.3 卵巢癌組中不同miR-204表達(dá)水平患者無進(jìn)展生存率和總生存率比較

將卵巢癌組患者分為外周血miR-204表達(dá)水平≥中位數(shù)的高表達(dá)患者、miR-204表達(dá)水平<中位數(shù)的低表達(dá)患者，繪制PFS和OS的Kaplan-Meier曲線，與miR-204低表達(dá)患者比較，miR-204高表達(dá)患者的PFS及OS均明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、圖2。

2.4 miR-204靶向Bcl-2、BDNF的臨床樣本驗(yàn)證

經(jīng)western blot檢測(cè)卵巢癌組織中Bcl-2、BDNF的表達(dá)水平，與miR-204低表達(dá)患者比較，miR-204高表達(dá)患者卵巢癌組織中Bcl-2、BDNF的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見下頁(yè)表2，圖3；經(jīng)Targetscan網(wǎng)站分析miR-204的靶基因，Bcl-2及BDNF基因mRNA 3′UTR中含有miR-204的結(jié)合靶點(diǎn)，見下頁(yè)圖4。

圖1 miR-204低表達(dá)與高表達(dá)患者PFS的Kaplan-Meier曲線

圖2 miR-204低表達(dá)與高表達(dá)患者OS的Kaplan-Meier曲線

圖3 卵巢癌組中不同miR-204表達(dá)水平患者 Bcl-2、BDNF的蛋白條帶

表2 卵巢癌組中不同miR-204表達(dá)水平患者Bcl-2、BDNF表達(dá)水平比較

圖4 miR-204靶向Bcl-2及BDNF基因 mRNA 3′UTR的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

2.5 miR-204靶向Bcl-2、BDNF的雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證

在SKOV3細(xì)胞中，miR-204組野生型Bcl-2報(bào)告基因的熒光活力、野生型BDNF報(bào)告基因的熒光活力均低于miR-NC組(P<0.05)；根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行突變，miR-204組突變型Bcl-2報(bào)告基因的熒光活力、突變型BDNF報(bào)告基因的熒光活力與miR-NC組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、圖6。

注：與miR-NC組比較，*P<0.05圖5 miR-NC組與miR-204組Bcl-2報(bào)告基因熒光活力的比較

注：與miR-NC組比較，*P<0.05圖6 miR-NC組與miR-204組BDNF報(bào)告基因熒光活力的比較

3 討論

卵巢癌的發(fā)病涉及多基因、多步驟，但具體的分子機(jī)制并不明確，臨床上不僅缺乏診斷卵巢癌及評(píng)價(jià)卵巢癌病情、預(yù)后的分子標(biāo)志物，也缺乏有效的靶向治療手段。近些年，miRNA在卵巢癌發(fā)病中的作用受到越來越多關(guān)注，多種miRNA被證實(shí)在卵巢癌組織中異常表達(dá)并起到促癌或抑癌作用[5-6]，同時(shí)也有研究關(guān)注了外周血miRNA在卵巢癌診斷及病情評(píng)估中的價(jià)值[7]。miR-204是一種具有抑癌作用的miRNA，根據(jù)Yuan D等[8]、Liang CY等[9]、Zhuang Z等[10]的研究結(jié)果，miR-204在卵巢癌、肺癌、頭頸部惡性腫瘤中的表達(dá)均顯著下調(diào)。除了在腫瘤組織中可檢測(cè)到miR-204外，在外周血中也可檢測(cè)到miR-204的表達(dá)，Li X等[11]和Estephan LE等[12]的研究報(bào)道了外周血miR-204對(duì)肺動(dòng)脈高壓的診斷及評(píng)估價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)：卵巢癌患者外周血中miR-204的表達(dá)水平低于對(duì)照組，與其在卵巢癌中表達(dá)降低的趨勢(shì)一致，提示卵巢癌患者外周血miR-204的低表達(dá)可能可以用于病情及預(yù)后的評(píng)估。

miR-204的抑癌作用已經(jīng)被多項(xiàng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Guo J 等[13]的研究證實(shí)，miR-204能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖；Zhang J等[14]的研究證實(shí)，miR-204對(duì)胃癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有抑制作用；Tang J等[15]的研究證實(shí)，miR-204對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中，癌細(xì)胞過度的增殖和侵襲與病情發(fā)展、病理特征惡化密切相關(guān)，miR-204表達(dá)降低可能削弱其抑制增殖、侵襲的作用，進(jìn)而參與病情發(fā)展及病理特征變化。本研究通過分析不同臨床病理特征卵巢癌患者外周血miR-204表達(dá)的差異可知：miR-204的表達(dá)水平與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA125水平有關(guān)，隨著FIGO分期的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生、CA125水平的升高，外周血miR-204的表達(dá)水平明顯降低，表明卵巢癌患者外周血miR-204表達(dá)水平的降低與多項(xiàng)臨床病理特征的惡化有關(guān)，提示miR-204低表達(dá)參與了卵巢癌病情的發(fā)展、與其在體外實(shí)驗(yàn)中介導(dǎo)的抑癌作用吻合。

國(guó)內(nèi)多項(xiàng)關(guān)于卵巢癌預(yù)后因素的臨床研究認(rèn)為，F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA125水平是生存預(yù)后的影響因素[16-18]；本研究已經(jīng)證實(shí)，miR-204低表達(dá)與三項(xiàng)預(yù)后影響因素FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA125水平均存在相關(guān)關(guān)系。基于此，本研究對(duì)卵巢癌患者的PFS和OS進(jìn)行了隨訪，繪制Kaplan-Meier曲線后通過Log-rank檢驗(yàn)分析不同miR-204表達(dá)水平的患者PFS和OS的差異可知：miR-204高表達(dá)患者的PFS及OS均明顯提高。這一結(jié)果表明，卵巢癌患者外周血miR-204低表達(dá)與遠(yuǎn)期生存情況的惡化有關(guān)，與其促進(jìn)臨床病理特征惡化的結(jié)果及臨床病理特征惡化是預(yù)后影響因素的結(jié)果一致。

miRNA通過結(jié)合靶基因mRNA 3′UTR在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。卵巢癌中miR-204調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲的研究顯示，miR-204能夠抑制Bcl-2和BDNF的表達(dá)。Bcl-2和BDNF是兩種在卵巢癌中高表達(dá)的基因[19-20]，相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Bcl-2和BDNF能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲，抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡[21-22]。國(guó)內(nèi)閆洪亮等[3]和范曉紅等[4]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-204能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中BDNF、Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究在上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析及臨床樣本檢測(cè)的方式驗(yàn)證了miR-204對(duì)BDNF和Bcl-2的靶向作用。在Targetscan中進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：miR-204分別靶向BDNF基因mRNA 3′UTR的第178-184堿基、Bcl-2基因基因mRNA 3′UTR的第209-216堿基；檢測(cè)BDNF和Bcl-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：miR-204高表達(dá)患者卵巢癌組織中Bcl-2、BDNF的表達(dá)水平均低于miR-204低表達(dá)患者。以上結(jié)果表明，miR-204能夠靶向Bcl-2、BDNF，當(dāng)miR-204表達(dá)增加時(shí)，Bcl-2、BDNF的表達(dá)相應(yīng)減少。此外，本研究還通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了miR-204靶向Bcl-2、BDNF的驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物后，細(xì)胞中野生型Bcl-2、BDNF報(bào)告基因的熒光活力降低，而根據(jù)Targetscan中進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告基因的突變后、miR-204不再影響報(bào)告基因的熒光活力，以上結(jié)果表明miR-204靶向Bcl-2及BDNF基因mRNA 3′UTR且靶向位點(diǎn)與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)一致。

綜上所述，卵巢癌患者外周血中miR-204的表達(dá)明顯降低，低表達(dá)的miR-204與病理特征及生存情況惡化有關(guān)，同時(shí)也與Bcl-2及BDNF表達(dá)增多有關(guān)，靶向Bcl-2及BDNF可能是miR-204參與卵巢癌發(fā)病及病情發(fā)展的分子機(jī)制。