劉賀，張彬，任禛，彭聲靜，張瑜瑜

（1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650214）

（2.德州職業(yè)技術(shù)學(xué)院谷物及油脂工程學(xué)院，山東德州 253034）

利用動物鮮骨提取“骨素”的方法最早起源于日本，隨著消費(fèi)習(xí)慣的改變，加之骨素以及骨素下游新產(chǎn)品味美、天然、無毒副作用的特殊優(yōu)勢，在短短的十年間得到了迅速發(fā)展，進(jìn)而取代了大部分的化學(xué)調(diào)味料，到80年代中期進(jìn)入了全盛時代[1]。

目前有關(guān)豬骨素的研究集中在三個方面，一是豬骨素提取工藝的研究，如白艷紅等[2]以豬骨為原料，將不同蛋白酶復(fù)配并優(yōu)化酶解工藝以制取豬骨素；張杰等[3]對提取壓力、時間及料液比進(jìn)行優(yōu)化，確定了豬骨素的最佳提取工藝；二是豬骨素酶解制備肉味香精，肖作兵等[4]以豬骨素酶解液為原料，通過美拉德反應(yīng)制備了肉味香精前體物質(zhì)，秦小濱等[5]則通過用不同酶對豬骨素進(jìn)行酶解處理后發(fā)現(xiàn)風(fēng)味酶處理后揮發(fā)性物質(zhì)增加；三是發(fā)酵豬骨素以改良風(fēng)味，如馬國霞等[6]、張宇等[7]研究表明紅曲霉與米曲霉雙菌發(fā)酵有利于改良豬骨素風(fēng)味。綜上，豬骨素在食品工業(yè)中常用來增加食物的濃厚感（thickness）、飽滿感（mouthfulness）、持續(xù)性（continuity），而用以描述這些感覺的物質(zhì)被稱為kokumi物質(zhì)[8]，該類物質(zhì)添加到基本味道溶液中時，會提升鮮味的呈味強(qiáng)度[9]。

目前已報道的kokumi物質(zhì)多為短肽類，如γ-谷氨酰多肽[10-13]，它們可增強(qiáng)食物濃厚味、延長回味或提升鮮味強(qiáng)度。夏秀芳[14]研究發(fā)現(xiàn)，鮮骨中蛋白質(zhì)含量為11%左右，而加工成骨素后其蛋白質(zhì)含量能達(dá)到30%以上。Chiti等[15]指出，聚合或形成聚集體是所有蛋白質(zhì)的固有特性，有研究[16-19]表明，蛋白及肽類物質(zhì)在制備及儲存過程中會通過疏水性相互作用等發(fā)生聚集，形成分子量較大的聚合物。而目前有關(guān)kokumi肽的研究多在于提取、合成較小肽段（2～3肽）[20-26]，經(jīng)計算，其分子量范圍一般在10 ku以下。研究kokumi單體小肽的增鮮作用，而忽視了肽的聚集作用與增鮮作用間的關(guān)系。

在食品適口性領(lǐng)域，味道及香氣之間的相互作用，尤其是鼻后香氣，從研究角度講是一個有趣的領(lǐng)域。在日本，kokumi與味道（taste）、香氣（aroma）、質(zhì)構(gòu)等共同用來評價食品的適口性。最近有一些關(guān)于鼻后香氣和味道之間相互作用的報道。Nishimura等[27]研究發(fā)現(xiàn)，具有kokumi屬性的濃縮洋蔥汁可以讓食用者產(chǎn)生持續(xù)的香氣感受；陳年味增及高達(dá)芝士中的美拉德肽具有kokumi屬性，可增強(qiáng)鮮味味道，當(dāng)將其加入到食物中時，還可增強(qiáng)鼻后香氣[28,29]。此外，有些鼻后香氣物質(zhì)如西梅干及菱角的呈香物質(zhì)加入到蔗糖溶液后會增強(qiáng)其甜味感受強(qiáng)度[30]，那么豬骨素中含有的kokumi增鮮肽與鼻后香氣間相互作用如何仍需進(jìn)一步研究。

因此本文選取目前常用于增鮮提鮮的蛋白/肽含量較高的豬骨素為原料，對賦予其中起到增鮮作用的kokumi蛋白質(zhì)或肽組分進(jìn)行分段，并對各組分的氨基酸含量、疏水性等性質(zhì)進(jìn)行分析評價，探索豬骨素各kokumi組分的氨基酸含量、疏水性等特性與其增鮮、增香氣鼻后感受強(qiáng)度間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬骨素，遼寧獨(dú)鳳軒有限公司；乙腈（HPLC級）、三氟乙酸（HPLC級）；Tris堿（分析純）；L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、DL-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、肌苷（Inosine）、次黃嘌呤（Hypoxanthine）、乳酸、醋酸、KOH、K2HPO4、MgCl2、CaCl2（以上均為GR級）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（北京，中國）；2-甲基吡嗪（GR），2-乙基-4-甲基噻唑（GR），3-(甲硫基)丙醛（GR）、2,4-癸二烯醛（GR），購自Sigma-Aldrich（美國）；AMP購自O(shè)riental Yeast Co.（日本）；NaCl、MSG（食品級）。

1.2 豬骨素基本性質(zhì)分析方法

蛋白質(zhì)含量測定方法：分光光度法（GB 5009.5-2016）；脂肪含量測定方法：索氏抽提法（GB 5009.6-2016）；鐵含量測定方法：火焰原子吸收光譜法（GB 5009.90-2016）；鈣含量測定方法：火焰原子吸收光譜法（GB 5009.92-2016）；磷含量測定方法：鉬藍(lán)分光光度法（GB/T 5009.87-2016）。

1.3 不同分子量段豬骨素肽樣品制備方法

將豬骨素粉配制成為濃度為2%（m/V）的水溶液，將該溶液以10 ku與30 ku超濾膜進(jìn)行分段，分別收集分子量為＜10 ku、10～30 ku及＞30 ku的豬骨素肽段組分，真空冷凍干燥得到各組分凍干粉，備用。

1.4 鮮味劑中蛋白/肽分子量分布的測定

采用體積排阻高效液相色譜法（SE-HPLC）測定。分別稱取20 mg待測樣品溶于0.03 mol/L的pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，配制成濃度為5 mg/mL的溶液，用直徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。色譜條件：Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：Protein Pak 60凝膠色譜柱（Waters，分離范圍1～20 ku）；流動相：0.03 mol/L的pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液；檢測：214 nm；流速0.5 mL/min；檢測溫度為27 ℃。分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為：胰蛋白酶抑制劑（Mw20100）、蛋清溶菌酶（Mw14400）、AB2-80（Mw7823）、AB2-81（Mw5856）、AB2-95（Mw3313），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)與保留時間作回歸分析，獲得的回歸方程為T=35.499-5.0457 log(Mw)（R2=0.9923，p＜0.05），式中，MW為分子量，T為保留時間。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)與保留時間之間的回歸方程計算樣品的分子量分布。

1.5 反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析柱分析鮮味劑中蛋白/肽

將待測樣品溶于含有0.1% TFA的超純水中，樣品經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液以RP-HPLC系統(tǒng)進(jìn)行定性分析。色譜柱：分析柱ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；洗脫溶劑為0.1% TFA（A）和0.1% TFA配制的80%的乙腈溶液（C），用A和C的混合液進(jìn)行梯度洗脫，溶劑C體積分?jǐn)?shù)：0 min-1%，25 min-20%，35 min-35%，50 min-50%。洗脫時間55 min，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：214 nm，上樣量：20 μL。吸光值在數(shù)據(jù)上以電壓的形式表示。

1.6 鮮味劑可溶性蛋白/肽含量測定

以Folin-酚法進(jìn)行樣品肽含量測定。測定方法參考Lowry法，以牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[31]。

1.7 鮮味劑游離氨基酸含量測定

采用色譜法進(jìn)行氨基酸分析，將17種氨基酸混合標(biāo)樣（PN：5061-3331）以漩渦振蕩器混合，以備進(jìn)樣（1 mol/L），并繪制氨基酸混合液的校正曲線。將樣品配制到合適濃度以安捷倫1100HPLC儀器進(jìn)行測定，所用色譜柱為ZORBAX Eclipse-AAA。

1.8 表面疏水性指數(shù)測定

表面疏水性指數(shù)的測定采用1-苯胺基-8-萘磺酸（1-Anilino-8-Naphthalene- Sulfonate，ANS）熒光探針法。

將待測樣品按照1 mg/mL的濃度溶于pH 7.2，0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，攪拌至充分溶解。用統(tǒng)一緩沖液將PBE各組分溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL；分別取4.5 mL不同濃度的樣品溶液，加入0.5 mL ANS（濃度1.25×10-3mol/L，溶于pH 7.2，0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液）溶液中，室溫下混合均勻，反應(yīng)液避光靜置2 h，測定反應(yīng)液熒光強(qiáng)度I。

以待測樣品濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)液熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，所得擬合直線的斜率即為待測樣品的表面疏水性指數(shù)S0。

1.9 品評員培訓(xùn)

10位品評員（男=6，女=4，平均年齡28.9）在知情的情況下同意參與本次研究的感官測試，并且沒有已知的味覺障礙病史。感官品評團(tuán)隊成員篩選方法參照GB/T 16291.1-2012、GB/T 16291.2-2010進(jìn)行。

味覺訓(xùn)練（用鼻夾）：使用溶解在純凈水（pH 6.0）中的以下參考味覺化合物的水溶液（各2 mL）：甜味用蔗糖（50 mmol/L），酸味用乳酸（20 mmol/L），咸味用NaCl（30 mmol/L），苦味用咖啡因（1 mmol/L），L-谷氨酸鈉（3 mmol/L）用于鮮味，收斂感用單寧酸（0.05%）；粘度訓(xùn)練用明膠溶液（0.5%水溶液）；kokumi味覺訓(xùn)練：模型雞湯（pH值為6.5）中加入不同濃度的谷胱甘肽。其中，模型雞湯熬制配制方法參考，略有調(diào)整[27]。所用物質(zhì)如表1所示。

香氣及鼻后香氣訓(xùn)練（不用鼻夾）：選取肉湯主要香氣物質(zhì)壬醛（油脂香、甜橙香）、己醛（油脂香、青草香）、1-辛烯-3醇（蘑菇香氣）等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用調(diào)味水溶液加入不同濃度的香氣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備成訓(xùn)練樣品。以聞香紙蘸取1.5～2 cm樣品溶液，橫向置于鼻前2～3 cm處嗅聞；然后將模型雞湯加熱到60 ℃后，迅速加入上述不同濃度香氣物質(zhì)制備成訓(xùn)練樣品，讓品評員在吞下訓(xùn)練樣品后迅速評價鼻后香氣強(qiáng)度。調(diào)味水溶液配制方法：將0.38 μg/kg 2-甲基吡嗪，0.28 μg/kg 2-乙基-4-甲基噻唑，3.79 μg/kg 3-(甲硫基)丙醛及19.49 μg/kg 2,4-癸二烯醛加入到0.4% NaCl溶液中。

表1 模型雞湯添加的化合物及其濃度Table 1 Composition of taste compounds in model chicken soup

1.10 豬骨素不同組分的增鮮效果評價方法

10位品評員在小組討論中列出樣品屬性詞語，并對屬性所表達(dá)的感覺達(dá)成共識。最后，小組品評員依據(jù)訓(xùn)練情況并參考文獻(xiàn)開發(fā)了5個屬性：咸味、鮮味、濃厚度（thickness，品嘗后5 s內(nèi)的味覺增強(qiáng)）、連續(xù)性（continuity，品嘗后20 s的味覺強(qiáng)度）、口感豐富度（mouthfulness，整個口腔的味覺增強(qiáng)，而不僅僅是舌頭上的味覺）[32,33]，其中濃厚度、連續(xù)性及口感豐富度為增鮮效果評價主要指標(biāo)。

將豬骨素組分（＜10 ku、10～30 ku及＞30 ku）分別加入到對照溶液（濃度為10 mmol/L的NaCl或MSG）中，使各組分終濃度為1%。將樣品溶液隨機(jī)提供給品評員。樣品和對照溶液均在口中放置10 s后吞咽，每個樣品在25 s內(nèi)評分。每個樣品的評分從1到9，對照溶液給定評分為“5”。以各個屬性值的平均得分繪制雷達(dá)圖，以確定豬骨素不同組分的增鮮效果。

1.11 豬骨素不同組分對鼻后香氣感受強(qiáng)度的影響作用

將豬骨素組分（＜10 ku、10～30 ku及＞30 ku）加入到1.9中調(diào)味水溶液中，使各組分終濃度為1%。10位品評員按照1.9中方法進(jìn)行鼻后香氣強(qiáng)度評分，其中調(diào)味水溶液為對照，給定評分為“5”。提供純凈水給品評員以恢復(fù)味覺。

1.12 熱處理下豬骨素各組分疏水性與其增鮮、增鼻后香氣感受效果驗證

將豬骨素各組分（＜10 ku、10～30 ku及＞30 ku）溶液（終濃度1%）置于相應(yīng)設(shè)定溫度（40、70 ℃）的水浴鍋中進(jìn)行加熱，當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定溫度后進(jìn)行30 min保溫處理，將達(dá)到設(shè)定熱處理溫度和時間的豬骨素溶液迅速冷卻至室溫按1.8中方法進(jìn)行表面疏水性指數(shù)測定，并按1.10、1.11中方法進(jìn)行增鮮、增鼻后香氣感受程度的評價。

1.13 數(shù)據(jù)處理及分析

所有的實驗重復(fù)至少三次，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，以方差分析ANOVA來檢測平均值之間的顯著性差異，p＜0.05。用Origin Pro 8.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬骨素的基本性質(zhì)

表2 豬骨素的產(chǎn)品性質(zhì)分析Table 2 Properties of PBEs

以可溶性蛋白質(zhì)含量較高的PBEs為研究材料，分析其基本性質(zhì)，探討其增鮮屬性與PBEs蛋白質(zhì)/肽含量的關(guān)系。通過進(jìn)一步的分離和分析，探討了PBEs各分子量段組分增強(qiáng)鮮味強(qiáng)度的機(jī)理，為食品工業(yè)的味覺調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。按國家標(biāo)準(zhǔn)或?qū)嶒炇曳椒▽BEs的組成和基本性能進(jìn)行了分析。

結(jié)果表明，PBEs蛋白含量極高（72.0%），總氨基酸含量（包括甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸等16種氨基酸，不含半胱氨酸）為67.6%。產(chǎn)品本身含有NaCl，其含量為9.53 g/100 g，可能與鮮味增強(qiáng)相關(guān)。磷含量為48.1 mg/100 g，有研究表明磷酸鹽的存在可能對鮮味物質(zhì)的鼻后香氣感受起到一定增強(qiáng)作用[27]。

2.2 豬骨素的氨基酸組成分析

采用氨基酸自動測定儀對豬骨素的氨基酸組成進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示。由表3可見，豬骨素中氨基酸的種類基本齊全，不含Cys半胱氨酸，呈味氨基酸占氨基酸總量的72.90%，其中呈鮮味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）占17.30%，呈甜味氨基酸（絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸、脯氨酸）55.60%。此外，疏水性氨基酸（丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸和亮氨酸）占34.70%。

表3 豬骨素及各組分的氨基酸組成（%）Table 3 Amino acid composition of PBEs and each fraction (%)

2.3 PBEs分子量分布特征及聚集驅(qū)動力

PBE（5 mg/mL）在pH 7.4下溶解于Tris-HCl以及尿素、十二烷基磺酸鈉處理的PBE的分子量分布情況如圖1所示。尿素和十二烷基硫酸鈉是蛋白質(zhì)變性劑，可以破壞肽鏈之間的氫鍵和疏水相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或聚集體的分解[19]。經(jīng)分子量計算，未經(jīng)變性劑處理時，PBE中，PBE（＞30 ku）和PBE（10～30 ku）的組分分別占36.07%和61.93%，基本不含PBE（＜10 ku）組分，即PBE中的蛋白質(zhì)或肽可能發(fā)生了聚集，因其分子量分布集中在高分子量部分。

當(dāng)用6 mol/L尿素處理后，低分子蛋白質(zhì)PBE（＜10 ku）組分被釋放出來，含量達(dá)到25.78%，PBE（10～30 ku）組分也增加至68.65%，相應(yīng)的PBE（＞30 ku）組分降低至5.57%；而以6 mol/L尿素和0.5%十二烷基硫酸鈉處理時，變性劑的作用強(qiáng)度更為明顯，PBE（＜10 ku）組分含量可增至36.73%，PBE（10～30 ku）組分增加至60.32%，而PBE（＞30 ku）組分降低至2.95%。該結(jié)果表明，本研究中使用的PBE會通過氫鍵和分子間疏水相互作用形成聚集體。

圖1 PBE、用6 M尿素處理的PBE、6 M尿素和0.5%十二烷基硫酸鈉處理的PBE的分子量分布圖Fig.1 Molecular weight distribution profile of PBE, PBE treated with 6 M urea, and PBE treated with 6 M urea and 0.5% SDS

2.4 PBE中kokumi組分增鮮及增香氣鼻后感受強(qiáng)度評價

由以上分析可知，PBEs可以形成聚集體。因此，在本研究中，采用分子量截留法將PBE分為三個組分，即PBE（＜10 ku）、PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku），并對PBE中各kokumi組分的增鮮及增香程度的影響作用進(jìn)行了評價。

2.4.1 PBE各kokumi組分的增鮮效果評價

用NaCl或MSG作為參考溶液，評估PBEs各kokumi組分的鮮味增強(qiáng)特性（圖2），其中厚度、口感豐富度和連續(xù)性通常用于評估kokumi肽類物質(zhì)的鮮味增強(qiáng)能力[20]。

圖2 感官譜圖Fig.2 Sensory radar charts

如圖2所示，在分別以NaCl和MSG為對照溶液的感官評估中，PBE（10～30 ku）組分得分均高于其他兩個部分。在以NaCl為對照的感官評價中（圖2a），PBE（＜10 ku）的咸味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分分別為7.9、6.8、6.7、6.9，PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）的咸味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分則分別為7.6、8.6、7.6、8.0及6.6、7.7、6.0、7.5。即PBE（＜10 ku）和PBE（10～30 ku）組分顯著提高了對照溶液的咸味和連續(xù)性，而PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）則顯著增加了溶液的厚度和口感豐富度。綜上，PBE（10～30 ku）組分在以NaCl為基底的溶液中，對各指標(biāo)的增鮮能力均強(qiáng)于另兩種組分。

與NaCl組相比，以MSG為對照溶液的感官評價結(jié)果（圖2b）與上述結(jié)果一致，PBE（＜10 ku）的鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分分別為7.7、7.4、7.4、7.5，PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）的鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分則分別為7.1、7.9、7.9、7.8及7.4、7.3、7.0、7.2。但變化程度明顯低于以NaCl為對照的組。PBE（10～30 ku）鮮味感受強(qiáng)度評分略低于另兩組分，但差異不具顯著性（p＞0.05），而濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度等指標(biāo)的評分均顯著高于另兩組分（p＜0.05）。

由上述分析可知，無論以NaCl還是以MSG為基底的溶液中，PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）的增鮮效果均強(qiáng)于PBE（＜10 ku）組分，而PBE（10～30 ku）組分的增鮮能力又高于PBE（＞30 ku）組分。這顯然與一些研究認(rèn)為只有低分子量短肽才能發(fā)揮kokumi效果的結(jié)論有所不同。

2.4.2 PBE各kokumi組分對調(diào)味溶液香氣鼻后感受強(qiáng)度的影響評價

盡管味道和香味提供了不同的感覺，并被不同的器官感知，但當(dāng)食物放進(jìn)嘴里時，它們通常是同時被感知的。因此，通常認(rèn)為在食用食品時，很難清楚的區(qū)分味道的感受及食品的鼻后香氣。有研究表明，西梅干及菱角的呈香物質(zhì)加入到蔗糖溶液中會增強(qiáng)溶液的甜味強(qiáng)度[30]，而苯酞類化合物（芹菜中主要呈香物質(zhì)之一）以閾下感受濃度加入到雞肉湯中時可增強(qiáng)雞湯香氣[34]。Nishimura等[35]提出，在屠宰肉的老化過程中添加Glu和IMP可能會增強(qiáng)陳肉提取物中的鼻后香氣感受及鮮味感受。因此，本研究評估了PBEs組分對模型雞湯香氣強(qiáng)度的影響。

如圖3所示，PBE的所有組分均能增強(qiáng)模型雞湯的鼻后香氣感受強(qiáng)度，PBE（＜10 ku）、PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）的香氣感受強(qiáng)度評分分別為6.0、7.0及6.5，如1.11中所述，對照調(diào)味水溶液的給定評分為“5”，因此，PBE（＜10 ku）組分和PBE（＞30 ku）組分分別使鼻后香氣強(qiáng)度提高了1.2倍和1.38倍，但兩者之間差異不具顯著性（p＞0.05）。而PBE（10～30 ku）組分可使鼻后香氣感受強(qiáng)度提高1.5倍，與前兩組分相比有顯著性差異（p＜0.05）。即PBE（10～30 ku）組分對香氣鼻后感受的增強(qiáng)作用強(qiáng)于另兩組分。Nishimura等[27]研究認(rèn)為MSG及IMP等鮮味化合物可通過增強(qiáng)模型雞湯的鼻后香氣感受強(qiáng)度來達(dá)到類似于kokumi物質(zhì)的增鮮效果。

圖3 不同PBE組分對鼻后香氣感受強(qiáng)度的影響作用Fig.3 Different PBE fractions and their influence on the intensity of aroma sensation

那么豬骨素中各組分的增鮮增香效果機(jī)制如何仍需進(jìn)一步研究，因此本研究對PBE中三種組分PBE（＜10 ku）、PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）的基本特性如氨基酸組成和疏水性進(jìn)行了研究，以期對豬骨素各kokumi組分的增鮮及增強(qiáng)香氣鼻后感受的機(jī)制進(jìn)行初步探索。

2.5 PBE各kokumi組分的特性分析

2.5.1 PBEs各kokumi組分的氨基酸組成分析

有研究表明目前已報道的kokumi物質(zhì)多含有谷氨酸[8]，Nishimura等[27]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸和IMP均可通過增強(qiáng)香氣感受強(qiáng)度而增強(qiáng)樣品的鮮味感受。由此可推測，蛋白質(zhì)或肽的kokumi增鮮特性及香氣鼻后感受增強(qiáng)作用可能與其中各種氨基酸含量相關(guān)。但呈味氨基酸含量與增鮮及香氣鼻后感受增強(qiáng)作用間關(guān)系尚未見報道。本研究將主要對增鮮起到貢獻(xiàn)作用的氨基酸分為呈鮮味氨基酸（Asp、Glu）、呈甜味氨基酸（Ser、Gly和Ala、Pro），并對其含量與增鮮、增香氣感受間關(guān)系進(jìn)行分析。

如表3所示，PBE（＞30 ku）和PBE（10～30 ku）中谷氨酸含量分別為11.00%及9.95%，差異不具有顯著性（p＞0.05），但均顯著高于PBE（＜10 ku）的2.66%（p＜0.05）。進(jìn)一步對各組分中本身所含有的呈味氨基酸含量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBE（＞30 ku）和PBE（10～30 ku）中呈鮮味氨基酸含量分別為16.22%及14.7%，呈甜味氨基酸分別為53.97%及44.19%，同上，兩組分的呈鮮味及呈甜味氨基酸間差異均不具有顯著性（p＞0.05），但也均顯著高于PBE（＜10 ku）的9.83%（甜味氨基酸）及3.9%（鮮味氨基酸）（p＜0.05）。結(jié)合上述感官分析結(jié)果，組分PBE（＞30 ku）和PBE（10～30 ku）的增鮮效果均顯著高于組分PBE（＜10 ku），由此可推測呈味氨基酸含量可能與蛋白或肽的kokumi增鮮效果具有一定相關(guān)性，但盡管組分PBE（＞30 ku）和PBE（10～30 ku）的呈味氨基酸含量間差異不具顯著性，組分PBE（10～30 ku）的增鮮效果卻顯著高于組分PBE（＞30 ku）（圖2），這說明除呈味氨基酸外還有其他因素可影響豬骨素各組分的kokumi增鮮效果。

2.5.2 PBEs各kokumi組分的疏水性

有報道稱，目前已報道的kokumi物質(zhì)多為短肽類，分子量較低[36]，但本研究中感官評價結(jié)果顯示，PBE（10～30 ku）組分的kokumi增鮮效果（濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度）要強(qiáng)于PBE（＜10 ku）組分。Chiti等[15]指出聚合或形成聚集體是所有蛋白質(zhì)及肽的固有特性，蛋白質(zhì)或肽聚集一般會導(dǎo)致其疏水性氨基酸暴露，這種變化會使蛋白質(zhì)或肽類呈現(xiàn)苦味[37]。但也有研究指出，疏水性對一些味覺的呈現(xiàn)起著重要作用，如有研究報告表明，monellin（廣為人知的甜蛋白）中的疏水區(qū)域?qū)ζ湮队X呈現(xiàn)至關(guān)重要[38,39]。Lioe等[40]研究表明含有谷氨酸以及較多疏水性氨基酸的組分可增強(qiáng)鮮味感受。因此，對這3種組分的疏水性進(jìn)行了分析。

圖4 (a)PBE各組分的RP-HPLC譜圖；(b)PBE各組分的表面疏水性指數(shù)Fig.4 (a) RP-HPLC profiles of PBE fractions; (b) Surface hydrophobicity indices of PBE fractions

結(jié)果表明，PBE（＞30 ku）組分、PBE（10～30 ku）組分和PBE（＜10 ku）組分的疏水性氨基酸含量分別為36.44%、30.9%和6.77%。由于蛋白質(zhì)或肽聚集后的疏水性呈現(xiàn)是整體性行為，故進(jìn)一步分析了3種組分的RP-HPLC譜圖，如圖4a所示，PBE（10～30 ku）組分的保留時間（RT）主要集中在10～15 min和25～45 min，而PBE（＞30 ku）組分的RT則主要集中在32～45 min，根據(jù)RP-HPLC原理，疏水性較強(qiáng)的樣品其RT相對較晚。因此，從RT即可推斷，PBE（＞30 ku）組分的疏水性強(qiáng)于PBE（10～30 ku）組分。而PBE（＜10 ku）組分的保留時間（RT）集中在40～45 min，雖然整體RT要晚于另兩種組分，但由于該RT內(nèi)出峰組分含量較低（峰面積小于另兩種組分），故其疏水性較難判斷。

RP-HPLC譜圖反應(yīng)的是各樣品中疏水性不同的組分的分布，而ANS熒光探針法測定的則是蛋白質(zhì)或肽分子的表面疏水性指數(shù)，該指數(shù)可反應(yīng)蛋白質(zhì)或肽的表面疏水性。因此，進(jìn)一步采用ANS熒光探針法測定了各樣品的的表面疏水性指數(shù)，結(jié)果如圖4b所示。如圖所示，PBE（＞30 ku）組分的疏水性指數(shù)為66±2.51，高于PBE（10～30 ku）組分的60.00±1.33及PBE（＜10 ku）組分的55.00±1.20，且差異具有顯著性（p＜0.05）。

而由前面感官分析結(jié)果可知，PBE（10～30 ku）組分的增鮮及增強(qiáng)鮮味溶液的香氣鼻后感受強(qiáng)度能力均高于另外兩種組分。結(jié)合疏水性結(jié)果分析表明，只有在一定的疏水范圍內(nèi)，豬骨素組分的鮮味及香氣增強(qiáng)作用較強(qiáng)。究其原因，可能是PBE（＞30 ku）組分聚集，導(dǎo)致過多疏水性氨基酸暴露，而過多疏水性氨基酸暴露不會起到增鮮及增香作用，只會導(dǎo)致溶液產(chǎn)生苦味[41]，從而影響該組分的增鮮效果。

2.6 熱處理下豬骨素各組分疏水性與其增鮮、增鼻后香氣感受效果驗證

2.6.1 不同熱處理溫度下豬骨素各組分疏水性指數(shù)

由前所述，疏水性可能與豬骨素組分的增鮮及增香氣鼻后感受強(qiáng)度能力相關(guān)，且只有在一定的疏水性范圍內(nèi)，豬骨素組分的鮮味及香氣增強(qiáng)作用較強(qiáng)，為了進(jìn)一步研究豬骨素的表面疏水性及其鮮味、香氣鼻后感受增強(qiáng)作用間關(guān)系，有研究表明，加熱處理可增加蛋白質(zhì)或肽的疏水性[42]，故本研究進(jìn)一步以加熱方式在不改變豬骨素組分氨基酸組成等條件前提下，改變豬骨素組分的疏水性，以進(jìn)行上述關(guān)系研究。

圖5 不同熱處理溫度下PBE各組分的表面疏水性指數(shù)Fig.5 Surface hydrophobicity indices of PBE fractions under different treat temperatures

如圖5所示，40 ℃及70 ℃下加熱30 min豬骨素各肽段的表面疏水性指數(shù)均顯著增加（p＜0.05）。其中，40 ℃下時，PBE（＞30 ku）組分的疏水性指數(shù)為68.0±0.70，高于PBE（10～30 ku）組分的62.90±1.22及PBE（＜10 ku）組分的57.10±0.61，且差異具有顯著性（p＜0.05）。而70 ℃下時，PBE（＞30 ku）組分的疏水性指數(shù)升高至77.70±1.14，高于PBE（10～30 ku）組分的73.20±2.16及PBE（＜10 ku）組分的60.00±0.95，且差異具有顯著性（p＜0.05）。

進(jìn)一步對熱處理下各組分的增鮮及增鼻后香氣感受效果進(jìn)行了評價。

2.6.2 不同溫度處理下PBEs各kokumi組分疏水性與增鮮效果關(guān)系

圖6 感官譜圖Fig.6 Sensory radar charts

以MSG為對照溶液的感官評價結(jié)果如圖6所示，40 ℃處理下，PBE（＜10 ku）的鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分分別為7.5、7.4、7.4、7.5，而70 ℃處理下，其鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分則為7.5、7.5、7.6、7.6，該肽段中兩種處理下疏水性指數(shù)顯著性增加（p＜0.05），而增鮮效果指標(biāo)各評分也相應(yīng)增加，但差異尚不具顯著性（p＞0.05）。

而PBE（10～30 ku）在40 ℃處理下，鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分分別為7.2、7.9、8.0、8.1，該組分的疏水性指數(shù)在40 ℃熱處理后均顯著高于熱處理前，但其增鮮效果較熱處理前（圖6b）濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度等各指標(biāo)評分增加，且差異具有顯著性（p＜0.05）。而70 ℃處理下，其鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分則為7.3、6.8、6.8、7.0，70 ℃熱處理后的該組分疏水性指數(shù)高于40 ℃處理下的指數(shù)，且差異具有顯著性，但其增鮮各指標(biāo)（濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度）的評分卻與上述處理相比顯著降低（p＜0.05）。

PBE（＞30 ku）在40 ℃處理下的鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分則分別為7.3、6.8、6.8、7.0，而70 ℃處理下的鮮味、濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度評分分別為7.1、6.3、6.4、6.4。該組分的疏水性指標(biāo)在不同熱處理溫度下均顯著增加（p＜0.05），但濃厚度、連續(xù)性、口感豐富度等指標(biāo)評分均顯著低于未經(jīng)過熱處理時評分（p＜0.05）。需要注意的是，70 ℃處理下該組分已出現(xiàn)明顯苦味，推測是由過多疏水性氨基酸暴露所引起的。

綜上所述，在以MSG為基底的溶液中，40 ℃處理下，PBE（10～30 ku）的增鮮效果強(qiáng)于PBE（＜10 ku）、PBE（＞30 ku）組分；但70 ℃處理下，PBE（＜10 ku）組分的增鮮效果評分則高于PBE（10～30 ku）、PBE（＞30 ku）組分，即PBE（10～30 ku）的增鮮效果隨著疏水性進(jìn)一步增強(qiáng)反而下降。

2.6.3 PBEs各kokumi組分疏水性與增鼻后香氣效果關(guān)系

圖7 不同溫度處理PBE組分對鼻后香氣感受強(qiáng)度的影響作用Fig.7 PBE fractions and their influence on the intensity of aroma sensation under different temperature

如圖7所示，40 ℃處理下時（圖7a），PBE各組分均能增強(qiáng)模型雞湯的鼻后香氣感受強(qiáng)度，PBE（＜10 ku）、PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）的香氣感受強(qiáng)度評分分別為6.1、7.4、5.2，前兩組分分別使鼻后香氣強(qiáng)度提高了1.22倍和1.48倍，且兩者之間差異具有顯著性（p＜0.05）。與疏水性指數(shù)及增鮮指標(biāo)評分相對應(yīng)發(fā)現(xiàn)，該處理下前兩種組分的疏水性指數(shù)及增鮮指標(biāo)評分也均顯著性增加；而PBE（＞30 ku）較未進(jìn)行熱處理的組分疏水性指數(shù)顯著性增加，但增鮮指標(biāo)評分及增鼻后香氣評分卻均降低，且差異具有顯著性（p＜0.05）。

而70 ℃處理下時（圖7b），PBE（＜10 ku）、PBE（10～30 ku）和PBE（＞30 ku）的香氣感受強(qiáng)度評分分別為6.9、6.2、4.8，前兩組分分別使鼻后香氣強(qiáng)度提高了1.38倍和1.24倍，但兩者之間差異不具顯著性（p＞0.05），但PBE（＞30 ku）的香氣感受強(qiáng)度卻不及未處理及40 ℃處理，且差異具有顯著性（p＜0.05）。再與疏水性指數(shù)及增鮮指標(biāo)評分相對應(yīng)發(fā)現(xiàn)，該處理下PBE（＜10 ku）的疏水性指數(shù)增鮮指標(biāo)評分顯著性增加，而PBE（10～30 ku）組分的疏水性指數(shù)顯著增加，但其增鮮指標(biāo)評分卻低于未處理及40 ℃處理下評分，且差異具有顯著性（p＜0.05）；而PBE（＞30 ku）組分疏水性指數(shù)進(jìn)一步顯著性增高，但其增鮮指標(biāo)評分及增鼻后香氣評分卻均進(jìn)一步降低，且差異具有顯著性（p＜0.05）。

綜上所述，豬骨素各組分不同溫度處理下的疏水性指數(shù)、增鮮、增香氣鼻后感受能力間存在一定關(guān)系。以PBE（10～30 ku）組分為例，未處理時，其增鮮指標(biāo)評分、增香氣鼻后感受能力均強(qiáng)于另兩組分，當(dāng)40 ℃處理時，其疏水性指數(shù)顯著增加，增鮮及增香氣鼻后感官能力評分也均顯著性增強(qiáng)，但當(dāng)70 ℃處理時，其疏水性指數(shù)進(jìn)一步顯著性增加，但其增鮮及增香氣鼻后感受能力評分卻顯著性下降。即只有在一定的疏水范圍內(nèi)，豬骨素組分的鮮味及香氣增強(qiáng)作用較強(qiáng)。

3 結(jié)論

3.1 在我國，豬骨素是常用的增鮮劑，主要依賴其中含量較高（72.0%）的蛋白質(zhì)含量起到kokumi效果。本研究發(fā)現(xiàn)PBEs會發(fā)生蛋白質(zhì)聚集作用，而疏水相互作用是其聚集的驅(qū)動力，換言之，PBEs可能以聚集的蛋白質(zhì)或肽的形式而不是單體肽形式來起到kokumi的增鮮作用。

3.2 進(jìn)一步以分子量截留法將PBEs分為三個組分（＜10 ku、10～30 ku及＞30 ku），對各組分特性及感官分析研究發(fā)現(xiàn)，呈味氨基酸（鮮味、甜味）含量高可能對豬骨素中蛋白質(zhì)或肽的增鮮增香效果起到一定提升作用，而只有蛋白質(zhì)或肽的整體疏水性在一定范圍內(nèi)時，其鮮味及香氣增強(qiáng)作用才最佳；若整體疏水性過高，即使含有呈味氨基酸含量高其增鮮增香效果也較差。但PBE（10～30 ku）組分是直接增強(qiáng)鮮味感，還是通過鼻后香氣間接增強(qiáng)了鮮味味覺感受仍需進(jìn)一步研究。