張曉輝，季青霞，丁成新，畢艷紅，趙祥杰，王朝宇

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003)

桑椹為?？浦参铮∕orus albaL.）的果穗，是一種藥食兩用中藥材，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[1-3]。 現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，桑椹含有豐富的總糖、維生素、礦物質(zhì)和人體必需氨基酸等，具有調(diào)節(jié)免疫力、降血脂、改善貧血、預(yù)防心血管疾病及改善新陳代謝等藥理作用，被譽(yù)為“21世紀(jì)的最佳保健果品”[4-6]。桑椹花青素是桑椹中關(guān)鍵的功能性成分，尤以矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷為主，含量占到總花青素的90%以上[7]，廣泛用于酸性食品、日用品、醫(yī)藥保健食品等行業(yè)。

以“石化溶劑”為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)花青素提取工藝往往存在能耗高、污染環(huán)境、提取率低及工業(yè)化生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)[8]。且由于桑椹花青素結(jié)構(gòu)中存在活性多羥基結(jié)構(gòu)，其提取過程中對(duì)酸堿度、氧化還原劑、光照、溫度及金屬離子等因素敏感，極易導(dǎo)致活性喪失，從而改變色澤或色澤消失[9]。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvent，DES）是一類由氫鍵受體（如季銨鹽、季磷鹽等）和氫鍵供體（如羧酸、酰胺或多元醇等）組成的共熔混合物，具有溶解化合物能力強(qiáng)、可設(shè)計(jì)、綠色可降解等優(yōu)點(diǎn)，目前已開始應(yīng)用于天然活性成分的分離提取、富集純化等方面[10-13]。如Choi等[14]發(fā)現(xiàn)槲皮素、蘆丁在氯化膽堿基DES中的溶解度是水相中的18～460,000倍，顯示出DES對(duì)該類化合物優(yōu)異的萃取能力。Dai等[15]考察了DES中長(zhǎng)春花花青素的提取率及穩(wěn)定性，結(jié)果表明此類花青素在乳酸-葡萄糖中的穩(wěn)定性與酸性乙醇相比提高了3倍。

然而，盡管DES已展現(xiàn)出良好的科學(xué)價(jià)值和應(yīng)用前景，但目前DES在上述領(lǐng)域的研究仍然停留在“試錯(cuò)法”階段，尚無理論、經(jīng)驗(yàn)規(guī)律可借鑒。為此本研究將以DES為提取劑，以桑椹花青素的高效提取為目標(biāo)，探索DES的組成、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)對(duì)花青素提取的影響，構(gòu)建基于DES的花青素高效提取工藝，為活性天然產(chǎn)物的高效提取制備提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹鮮果，水分含量為85%，購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。氯化膽堿（CHCl）（≥98%）、尿素（UR）（≥99.5%）、冰乙酸（HA）（≥98%）、乳酸（HL）（≥98%）、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）、甲醇、無水乙醇、濃鹽酸、乙腈等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LYO GT2冷凍干燥機(jī)，上海將來實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-200VDE三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA2004B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器，上海皓莊儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；CT 15 RE高速冷凍離心機(jī)，日本日立電子科技有限公司。

1.3 DES的制備

依據(jù)參考文獻(xiàn)[16]的方法并稍作修改。將不同量的氫鍵受體和氫鍵供體加入到反應(yīng)瓶中磁力攪拌混合均勻（60～80 ℃，1～2 h），直到混合物變?yōu)闊o色澄清液體，之后轉(zhuǎn)移至真空干燥箱中，用P2O5充分干燥后備用。

1.4 桑椹花青素的提取

稱取2 g桑椹勻漿置于50 mL透明玻璃螺口瓶中，按照一定的液料比加入不同的提取劑，放入超聲波提取器中，在一定的溫度和提取時(shí)間內(nèi)進(jìn)行超聲提取。之后把混合液離心過濾（4 ℃，3000 r/min，20 min），取上清，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并濃縮，之后冷凍干燥48 h，得到桑椹花青素粗提物。

1.5 桑椹花青素提取得率的測(cè)定

參考已有研究[17]，采用pH示差法計(jì)算提取液中花青素的得率。在測(cè)得的花青素紫外最大吸收波長(zhǎng)和700 nm下采用紫外-可見分光光度法測(cè)定吸光度，含量計(jì)算公式如下：

式中：

A——吸光值，此處A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5；

MW——矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，449.2 g/mol；

?——矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26900 L/(mol·cm)；

DF——稀釋倍數(shù)；

L——光程，1 cm；

V——提取液的總體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.6 溶劑對(duì)桑椹花青素提取的影響

精確稱取1 g桑椹勻漿置于玻璃螺口瓶中，分別于不同的DES、去離子水、酸性乙醇（80%乙醇-0.4%鹽酸V-V）、95%乙醇中超聲提?。?0 ℃，10 min，料液比1/10），離心過濾（4 ℃，3000 r/min，20 min），取上清液稀釋6倍后測(cè)定花青素得率，實(shí)驗(yàn)平行三次。

1.7 桑椹花青素提取的單因素試驗(yàn)

1.7.1 含水量對(duì)桑椹花青素提取的影響

精確稱取1 g桑椹勻漿置于玻璃螺口瓶中，以CHCl/HA（1/3）為提取劑（文中DES組成比例均為摩爾比），并分別添加0～100%（間隔為20%）水到提取劑中，超聲提?。?0 ℃，10 min，料液比1/10），離心過濾（4 ℃，3000 r/min，20 min），取上清液稀釋6倍后測(cè)定花青素得率。

1.7.2 料液比比對(duì)桑椹花青素提取的影響

精確稱取1 g桑椹勻漿置于玻璃螺口瓶中，以CHCl/HA（1/3）-H2O（80/20V/V）為提取劑，分別以1/4、1/7、1/10、1/13、1/16為料液比，超聲提?。?0 ℃，10 min），離心過濾（4 ℃，3000 r/min，20 min），取上清液稀釋6倍后測(cè)定花青素得率。

1.7.3 溫度對(duì)桑椹花青素提取的影響

精確稱取1 g桑椹勻漿置于玻璃螺口瓶中，以CHCl/HA（1/3）-H2O（80/20V/V）為提取劑（料液比1/10）于30～70 ℃（間隔10 ℃）條件下超聲提取10 min，離心過濾（4 ℃，3000 r/min，20 min），取上清液稀釋6倍后測(cè)定花青素得率。

1.7.4 提取時(shí)間對(duì)超聲提取桑椹花青素的影響

精確稱取1 g桑椹勻漿置于玻璃螺口瓶中，以CHCl/HA（1/3）-H2O（80/20V/V）作為提取劑（料液比1/10），于60 ℃分別超聲提取10～50 min（間隔10 min），離心過濾（4 ℃，3000 r/min，20 min），取上清液稀釋6倍后測(cè)定花青素得率。

1.8 DES中桑椹花青素提取的響應(yīng)面優(yōu)化

選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)影響較為顯著的因素作為響應(yīng)因子，以桑椹花青素的得率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Bohnken中心組合法進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。提取劑為氯化膽堿/乙酸（1/3）-水（80/20V/V）的響應(yīng)面優(yōu)化。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental factors and horizontal design

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8和Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑椹花青素最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

以提取劑作為空白組，用紫外-可見分光光度儀在400～600 nm對(duì)7種不同類型的提取溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到桑椹花色苷的紫外-可見吸收光譜如圖1所示?？梢钥闯觯ｉ┗ㄇ嗨卦贑HCl/HL（1/3）、CHCl/HA（1/3）、CHCl/PG（1/3）、HL、HA、去離子水和95%乙醇中的最大紫外吸收波長(zhǎng)都在521 nm左右，這與馬義虔[18]和Zhang等[19]的研究報(bào)道一致。因此，在本實(shí)驗(yàn)測(cè)定桑椹花青素得率時(shí)，將521 nm作為桑椹花青素的最大紫外吸收波長(zhǎng)。

圖1 不同提取劑中桑椹花青素紫外-可見光掃描圖Fig.1 UV-visible spectroscopy of mulberry anthocyanins indifferent extraction solvents

2.2 提取劑對(duì)桑椹花青素提取得率的影響

表2 提取劑對(duì)桑椹花青素提取得率的影響Table 2 Effect of various solvents on the amount of anthocyanins yield from mulberry

以有機(jī)酸、酰胺和多元醇為氫鍵供體，以氯化膽堿為氫鍵受體制備了10種DES，再選取3種常用的提取溶劑（80%乙醇-0.4%鹽酸、95%乙醇和去離子水）為對(duì)比，考察了不同提取劑對(duì)桑椹花青素得率的影響。結(jié)果如表2所示，DESs的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及不同的傳統(tǒng)提取劑均會(huì)顯著影響花青素的得率。在所選用的DESs中，有6種顯示出較好的提取效果，其中以CHCl/HA（1/3）的得率最高，達(dá)4.05 mg/g；當(dāng)DES的氫鍵供體為多元醇時(shí)，花青素的得率普遍較低，為0.15～1.56 mg/g，明顯低于氫鍵供體為酸時(shí)的DESs，這是由于酸性提取環(huán)境更有利于保持花青素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，防止其降解[20]，這與羅政等[21]的研究結(jié)果一致。而當(dāng)氫鍵供體是堿性尿素時(shí)，其與CHCl的組合并未表現(xiàn)出提取作用，CHCl/UR的強(qiáng)堿性可能是導(dǎo)致其無法用于桑椹花青素提取的主要原因。研究結(jié)果還表明，DES的氫鍵供體和受體的組成比例同樣會(huì)影響花青素的得率，就CHCl/HA而言，隨著CHCl與HA摩爾比由2/3逐漸減小至1/5，花青素的得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，以1/3為最佳摩爾比。這主要?dú)w因于DES組成比例的變化會(huì)導(dǎo)致提取體系中氫鍵網(wǎng)絡(luò)的變化，進(jìn)而改變了其擴(kuò)散傳質(zhì)、極性以及pH值等特性。而就傳統(tǒng)提取溶劑而言，酸性溶劑80%乙醇-0.4%鹽酸的提取得率顯著優(yōu)于95%乙醇和去離子水的得率，這與李金星等[22]和曾林等[23]的研究類似，說明酸性溶劑更有助于花青素的提取。

2.3 桑椹花青素提取得率的單因素實(shí)驗(yàn)

以CHCl/HA為提取劑，研究了水含量、料液比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)桑椹花青素得率的影響。如圖2a所示，DES中水的添加會(huì)顯著的影響花青素的提取效果，如隨著水含量的不斷增加，花青素的得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)添加20%的水時(shí)花青素的得率最高，達(dá)4.59 mg/g。一般而言，DES本身的粘度較大，擴(kuò)散系數(shù)小，單純使用并不利于天然產(chǎn)物的提取。但Zeng等[24]在使用CHCl/UR從藜麥中提取總黃酮和20-羥基蛻皮激素時(shí)發(fā)現(xiàn)，在DES中添加一定比例的水會(huì)使DES的粘度明顯下降，顯著提高得率；但同時(shí)過量的水也會(huì)改變體系的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，減弱提取物與DES之間的氫鍵作用，導(dǎo)致目標(biāo)成分的難溶解[25]。

本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)的報(bào)道，考察了料液比為1/4～1/16對(duì)桑椹花青素得率的影響（圖2b），發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比為1/10時(shí)，花青素的得率顯著提高；繼續(xù)增加料液比，得率的變化不明顯，后續(xù)研究選擇的料液比為1/10，此時(shí)得率為4.48 mg/g。天然產(chǎn)物的提取得率往往隨著料液比的增加而增大，這是因?yàn)樘崛┑脑黾硬粌H可降低提取體系的粘度，而且溶劑和固體之間濃度梯度的增加會(huì)增加體系的擴(kuò)散速率，繼而提高目的提取物與提取劑的接觸面積，最終導(dǎo)致得率的增加。

Abbott等采用空穴理論模型得到的DES的熱傳輸性質(zhì)表明，升高溫度將賦予DES更高的能量，從而提高了溶劑分子的流動(dòng)性，增加體系的擴(kuò)散速率[26]；此外升高溫度還會(huì)提高細(xì)胞膜的通透性，更有利于天然化合物的浸出和溶解[27]。但過高的溫度會(huì)破壞花青素的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率的下降。如圖2c所示，隨著超聲溫度從30 ℃升至60 ℃，花青素的得率逐漸增加至最大，繼續(xù)升高溫度，得率則迅速降低。綜合考慮，CHCl/HA（1/3）-H2O（80/20V/V）的適宜提取溫度為60 ℃，與文獻(xiàn)[28]報(bào)道的最優(yōu)工藝的提取溫度相近,此時(shí)得率為5.67 mg/g。

圖2 不同因素對(duì)花青素提取得率的影響Fig.2 The effect of several parameters on anthocyandins yield

圖2d的結(jié)果顯示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素的得率也逐漸增加，并在40 min時(shí)達(dá)到最大，比文獻(xiàn)[28]報(bào)道的最優(yōu)工藝的超聲時(shí)間少95 min，此時(shí)得率為6.32 mg/g；但繼續(xù)增加提取時(shí)間，花青素的得率則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。延長(zhǎng)超聲時(shí)間一般會(huì)提高得率，但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使花青素暴露在自然環(huán)境中導(dǎo)致其降解，也會(huì)使其他非花青素成分大量溶出，降低花青素的純度[27]。

2.4 DES中桑椹花青素提取的響應(yīng)面優(yōu)化

利用Design-Expert軟件對(duì)表3中的響應(yīng)面分析方案的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及顯著性檢驗(yàn)，得到的回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析見表3。

表3 ChCl/HA(1/3)-H2O （80/20V/V）提取花青素的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Box-Behnken design for three variables and experimental results of anthocyanin yield using ChCl/HA (1/3)-water (80/20V/V) as extraction solvent

回歸擬合后得到的方程為：Y=6.3348+0.0850A- 0.0245B+0.0150C+0.0222AB+0.0114AC+0.0129BC- 0.0565A2-0.1830B2-0.1437C2。從上表可以看出，模型的F值為98.94，p＜0.0001＜0.05，這表明模型是顯著的。失擬項(xiàng)F值為0.5083，p值為0.6975＞0.05，差異不顯著，說明該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況良好，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾性較小，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起。同時(shí)，上表中各項(xiàng)方差分析表明，A、B、A2、B2、C2項(xiàng)（p(Pr＞F)＜0.05）對(duì)花青素提取得率的影響效果是顯著的，但C項(xiàng)和A、B、C之間交互作用對(duì)花青素提取得率的影響不顯著。從單因素來看，對(duì)花青素提取得率影響從大到小為：A＞B＞C。預(yù)測(cè)系數(shù)Pred R2=0.9567與調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.9822也是合理的，決定系數(shù)R2=0.9922以及調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.9822也表明實(shí)驗(yàn)擬合程度較好。

表4 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression equation coefficients and significant test

圖3顯示了料液比和提取溫度和時(shí)間對(duì)桑椹花青素得率的交互作用。由結(jié)果可知，響應(yīng)曲面越陡峭表明兩者之間的交互作用對(duì)桑椹花青素得率的影響越顯著，且料液比、提取溫度和時(shí)間對(duì)得率的影響依次減小。結(jié)合表3方差分析可知，料液比與提取溫度、提取溫度與時(shí)間以及料液比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)桑椹花青素的得率影響逐漸減小。由此可以得出CHCl/HA（1/3）-H2O（80/20V/V）提取桑椹花青素最佳條件為：料液比1/10、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間40 min，在該條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到花青素的平均得率為6.35 mg/g，略小于試驗(yàn)預(yù)測(cè)值6.36 mg/g，說明模型可靠。同時(shí)，本研究結(jié)果顯著高于程秀瑋等[28]人用酸性乙醇超聲提取桑椹花青素的得率5.09 mg/g。說明DES提取花青素是可行的。

圖3 不同因素對(duì)桑椹花青素得率的相互影響Fig.3 Interaction effects of different factors on the mulberry anthocyanin yield

3 結(jié)論

隨著“綠色化學(xué)”概念的提出，人們對(duì)食品、藥品及化妝品領(lǐng)域中所用溶劑的環(huán)保性和綠色性更為關(guān)注，而天然產(chǎn)物提取技術(shù)的“綠色”特性也主要體現(xiàn)在“溶劑”的選擇上。本文以桑椹鮮果為原料，以超聲方式為輔助手段，考察了新型綠色DES高效提取桑椹花青素的工藝，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，花青素提取量高達(dá)6.35 mg/g。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，由適當(dāng)比例氫鍵供體和受體所構(gòu)成的DESs在花青素提取過程中展現(xiàn)出了提取得率高、綠色無污染、簡(jiǎn)單易操作及原子經(jīng)濟(jì)等傳統(tǒng)有機(jī)溶劑所無法比擬的優(yōu)勢(shì)，展現(xiàn)出了DES在天然產(chǎn)物提取中的強(qiáng)大潛力，為DES溶劑的綠色高效利用提供了有益參考。