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        大豆球蛋白G4蛋白B3亞基導(dǎo)致中式高鹽稀態(tài)醬油 二次沉淀的形成

        2021-12-01 13:04:02馮拓單培高獻(xiàn)禮符姜燕胡鋒林虹徐婷王博張雅瓊
        現(xiàn)代食品科技 2021年11期
        關(guān)鍵詞:日式亞基中式

        馮拓,單培,高獻(xiàn)禮*,符姜燕,胡鋒,林虹,徐婷,王博,張雅瓊

        (1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)(2.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司,廣東中山 528401)

        醬油二次沉淀是指醬油包裝之后在儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售過(guò)程中在瓶底形成的沉淀,醬油二次沉淀一般為土黃色或紅棕色狀[1]。二次沉淀已成為影響中式高鹽稀態(tài)醬油外觀質(zhì)量的主要問(wèn)題。本課題組前期對(duì)市售中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油二次沉淀含量進(jìn)行了系統(tǒng)分析,結(jié)果顯示中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀含量比日式醬油高64%以上,外觀質(zhì)量明顯低于日式醬油[2,3]。此外,中式高鹽稀態(tài)醬油平均價(jià)格僅為日式醬油的1/12,兩者外觀質(zhì)量的差異被認(rèn)為是造成兩者巨大價(jià)格差異的關(guān)鍵原因之一[2]。

        日本科研人員已對(duì)日式醬油二次沉淀組成和影響其形成的因素進(jìn)行了深入的研究。日式醬油二次沉淀由約90%的蛋白質(zhì)及少量的多糖和食鹽組成[4]。日式醬油在加熱過(guò)程中可形成促進(jìn)“不穩(wěn)定蛋白質(zhì)”沉淀的酯類物質(zhì),該酯類物質(zhì)主要為谷氨酸正丁酯及其類似物,其中谷氨酸正丁酯在60 ℃時(shí)形成,是這類“促沉因子”主要成分[5-7]。此外,日本學(xué)者研究認(rèn)為大曲中帶入的耐熱中性蛋白酶和堿性蛋白酶與日式醬油二次沉淀的形成存在密切關(guān)系[2,7]。目前日式醬油已成功解決二次沉淀問(wèn)題,但由于技術(shù)保密的原因,尚未見到日式醬油二次沉淀去除技術(shù)的相關(guān)研究報(bào)道。

        國(guó)內(nèi)學(xué)者已對(duì)中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀成分進(jìn)行了初步分析,但對(duì)影響中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成的因素及其形成機(jī)制尚未進(jìn)行深入研究。曾新安等[1]和張志航等[8]研究指出中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀由大量無(wú)機(jī)鹽(NaCl)、蛋白質(zhì)、多糖及少量脂肪組成。這說(shuō)明中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油二次沉淀組成存在顯著差異。這是由于中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油所用菌種、原料、原料處理方式和發(fā)酵工藝的差異造成的[9,10]。本課題組在前人研究的基礎(chǔ)上,對(duì)中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀蛋白進(jìn)行了分離、鑒定和系統(tǒng)分析。結(jié)論如下:大豆11 S球蛋白G4蛋白中的B3亞基(76%)和G1蛋白中的A1a亞基(19%)是中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀蛋白的主要成分,兩種亞基“有序”二級(jí)結(jié)構(gòu)比例高和疏水性強(qiáng)導(dǎo)致其溶解度低,進(jìn)而形成沉淀[11]。令人困惑的是,中式高鹽稀態(tài)醬油中存在大量NaCl和多糖,兩者遠(yuǎn)未達(dá)到其理論飽和度,上述研究并不能合理解釋中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀中為何會(huì)存在大量NaCl和多糖。

        因此,本研究以日式醬油為對(duì)照,在系統(tǒng)分析影響中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀影響因素的基礎(chǔ)上,嘗試總結(jié)和推理中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成的機(jī)制,以期為解決中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀問(wèn)題提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料和儀器

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料和試劑

        國(guó)產(chǎn)生抽醬油(廣東某醬油廠)和日本龜甲萬(wàn)醬油(原產(chǎn)地日本)均為市售醬油,購(gòu)買于江蘇省鎮(zhèn)江市華潤(rùn)萬(wàn)家超市。中式高鹽稀態(tài)醬油以大豆、面粉和食鹽為原料,采用高鹽稀態(tài)釀造工藝生產(chǎn)而成,日本龜甲萬(wàn)醬油以脫脂大豆、小麥、食鹽為原料,采用日式工藝生產(chǎn)而成。中式高鹽稀態(tài)醬油生產(chǎn)日期為2019年10月(距購(gòu)買和實(shí)驗(yàn)日期1個(gè)月),日式醬油生產(chǎn)日期為2019年8月(距購(gòu)買和實(shí)驗(yàn)日期3個(gè)月),兩種醬油瓶底均暫無(wú)肉眼可見沉淀。

        可溶性大豆多糖購(gòu)買于河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。三氯化鐵、二氯化亞鐵、亞鐵氰化鉀、三氯乙酸、碘化鉀、甲醛、乙醇、NaCl、沒(méi)食子酸、鹽酸、硫酸、硼酸、四硼酸鈉、硫酸銅、葡萄糖、AgNO3、NaOH、Na2HPO4等均為分析純,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品IV和蛋白質(zhì)電泳預(yù)制膠均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

        大豆蛋白本酶解物制備方法:將5%大豆分離蛋白(河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司)在121 ℃下蒸煮15 min,降溫至45 ℃時(shí)添加諾維信風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme 1000 L(液體)),添加量為2000 U/g大豆分離蛋白,在搖床內(nèi)45 ℃恒溫酶解5 h(120 r/min)。酶解結(jié)束后升溫至100 ℃滅酶10 min,定性濾紙過(guò)濾,過(guò)濾液經(jīng)冷凍干燥得到大豆蛋白酶解物。

        1.1.2 主要儀器和設(shè)備

        MJ-70-I培養(yǎng)箱,上海恒一科學(xué)儀器有限公司;Kjeitec2300凱氏定氮儀,瑞典FOSS分析儀器有限公司;ULTS1368超低溫冰箱,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;WFZ UV-2100紫外分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;5415D高速離心機(jī),德國(guó)艾本德股份公司;THZ-300 THZ-300C恒溫?fù)u床,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FE 20 pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DZF-6020真空干燥箱,紹興市蘇珀儀器有限公司;Mini-PROTEAN?Tetra System垂直電泳(BIO-RAD,美國(guó));JEDA電泳掃描儀(JD-801,中國(guó));高效液相色譜儀及PICO. TAG色譜柱(Waters,美國(guó));基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)(Bruker-Daltonics,德國(guó))。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油常規(guī)理化指標(biāo)分析

        總氮、氨基酸態(tài)氮、氯化鈉、可溶性無(wú)鹽固形物、總酸的測(cè)定均按照GB 18186-2000規(guī)定檢測(cè)??偺呛瓦€原糖測(cè)定按照Z(yǔ)BX 66040-1987規(guī)定檢測(cè)。pH采用pH計(jì)直接測(cè)定。

        1.2.2 影響中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成因素分析

        1.2.2.1 pH對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        用濃度為6 mol/L的HCl或NaOH調(diào)整醬油(200 mL)的pH分別至2.5、3.5、4.5、5.5和6.5。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),使?jié)撛诘摹岸纬恋怼笨焖傩纬伞⒄瘴墨I(xiàn)[12]的方法收集和制備醬油二次沉淀,并做如下修改:震蕩結(jié)束后的醬油在0 ℃和10000 r/min條件下離心10 min,采用虹吸法移除上清,收集沉淀;將收集的沉淀在105 ℃烘干至恒重,計(jì)算醬油二次沉淀生成量。

        1.2.2.2 鐵離子對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        以三氯化鐵和二氯化鐵為鐵離子源,往中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中分別添加鐵離子,添加的Fe2+和Fe3+量分別為0、0.04‰、0.08‰和0.12‰。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),參照1.2.3.1部分方法收集和制備醬油二次沉淀。

        1.2.2.3 多酚對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        以沒(méi)食子酸為多酚源,往中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中分別添加沒(méi)食子酸,添加量分別為0、0.3%、0.6%和0.9%。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),參照1.2.3.1部分方法收集和制備醬油二次沉淀。

        1.2.2.4 多糖對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        往中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中分別添加大豆多糖,多糖添加量分別為0、3%、6%和9%。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),參照1.2.3.1部分方法收集和制備醬油二次沉淀。

        1.2.2.5 大豆蛋白酶解物對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        往中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中分別添加大豆蛋白酶解物,大豆蛋白酶解物添加量分別為0、1.5%、3%和4.5%。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),參照1.2.3.1部分方法收集和制備醬油二次沉淀。

        1.2.2.6 NaCl對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        往中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中分別添加NaCl,添加量分別為0、5%、10%和15%。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),參照1.2.3.1部分方法收集和制備醬油二次沉淀。

        1.2.2.7 乙醇對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        往中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中分別添加乙醇,添加量分別為0、0.6%、1.2%和1.8%。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),參照1.2.3.1部分方法收集和制備醬油二次沉淀。

        1.2.2.8 溫度對(duì)醬油二次沉淀形成的影響

        將中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中分別在-20、0、20、40和60 ℃恒溫箱保存7 d。將上述醬油樣品置于搖床中,在200 r/min的條件下震蕩7 d(50 ℃),參照1.2.3.1部分方法收集和制備醬油二次沉淀。

        1.2.3 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油游離氨基酸及疏水性分析

        采用高效液相色譜(HPLC)分析中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中的氨基酸組成。氨基酸檢測(cè)條件:美國(guó)Waters HPLC,PICO.TAG氨基酸分析柱,溫度為38 ℃,流速為1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,采用外標(biāo)法對(duì)氨基酸進(jìn)行定量。

        根據(jù)Lozano等[13]的經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算樣品氨基酸的疏水值(HΦavg):某游離氨基酸的疏水值為其占總游離氨基酸摩爾百分含量乘以其疏水值,總疏水值為所有氨基酸的疏水值之和。

        1.2.4 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油大豆蛋白B3亞基分析

        采用低溫-超聲法快速制備中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中的“潛在二次沉淀蛋白”[12]。收集兩種醬油二次沉淀,冷凍干燥后溶解于含有8 M尿素、60 mM DTT、50 mM Tris和1% SDS的水溶液中,并調(diào)整溶液蛋白質(zhì)含量至1 mg/mL。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離醬油二次沉淀蛋白,采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法對(duì)所分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,具體方法參照Gao等[11]的方法。

        1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

        表1 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油常規(guī)理化指標(biāo)Table 1 Proximate indices of Chinese-type high-salt and diluted-state soy sauce and Japanese-type soy sauce

        本文的所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)完成,在檢驗(yàn)水平為0.05的條件下進(jìn)行顯著性差異分析。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 中式高鹽稀態(tài)醬油與日式醬油理化指標(biāo)分析

        由表1可知,中式高鹽稀態(tài)醬油與日式醬油的氨基酸態(tài)氮、總糖和還原糖含量及pH存在顯著差異(p<0.05),兩種醬油的總氮、總酸、NaCl和非鹽固形物含量無(wú)顯著差異(p>0.05)。其中,中式高鹽稀態(tài)醬油、日式醬油氨基酸態(tài)氮含量分別為0.91、1.05 g/100 mL,均高于0.80 g/100 mL(我國(guó)釀造醬油標(biāo)準(zhǔn)中的特級(jí)醬油標(biāo)準(zhǔn)),說(shuō)明本研究所選用的兩種醬油的品質(zhì)優(yōu)于一般醬油,具備一定的代表性。中式高鹽稀態(tài)醬油與日式醬油的總酸含量與pH相符,且日式醬油的總酸含量為1.70 g/100 mL,略低于中式高鹽稀態(tài)醬油(1.76 g/100 mL),可能原因在于在日式醬油的發(fā)酵過(guò)程中會(huì)人為添加耐鹽酵母菌,而酵母的加入勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生一定量的乙醇,產(chǎn)生的部分乙醇會(huì)作為底物與有機(jī)酸類物質(zhì)反應(yīng)生成酯類化合物,從而導(dǎo)致日式醬油總酸含量的降低;此外,酵母的加入會(huì)在一定程度上消耗日式醬油中的還原糖物質(zhì),但日式醬油還原糖含量為5.43 g/100 mL,約為中式高鹽稀態(tài)醬油還原糖含量(3.47 g/100 mL)的1.6倍,原因可能是日本醬油發(fā)酵工藝相對(duì)更為成熟,能夠顯著地提高原料中淀粉等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用率。除總酸和pH之外,本次所檢測(cè)的中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油的其他指標(biāo)與馮云子等[14]所檢測(cè)的中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油指標(biāo)值基本相當(dāng)。醬油在醬醪發(fā)酵階段屬于開放式發(fā)酵,醬醪中微生物種類和數(shù)量受溫度、濕度、衛(wèi)生條件和環(huán)境中的微生物種類和數(shù)量的影響,這是造成兩次分析中總酸和pH差異較大的原因。值得注意的是,日式醬油的氨基酸轉(zhuǎn)化率(氨基酸態(tài)氮/總氮×100%)為73.43%,而中式高鹽稀態(tài)醬油的氨基酸轉(zhuǎn)化率僅為59.48%,說(shuō)明日式醬油中蛋白質(zhì)降解更徹底、殘留的蛋白質(zhì)更少。

        2.2 影響中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成因素分析

        如圖1a所示,中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量隨著pH的升高顯著下降(從5.01 mg/mL至2.23 mg/mL),說(shuō)明中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀中存在大量“酸不溶性物質(zhì)”。日式醬油pH從2.5升至5.5時(shí)二次沉淀生成量略有下降,pH升至6.5時(shí)二次沉淀生成量(1.8 mg/mL)顯著升高。上述結(jié)果說(shuō)明中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油二次沉淀成分和形成機(jī)制存在差異。中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀主要成分為NaCl、蛋白質(zhì)和多糖等[2],早期的文獻(xiàn)報(bào)道顯示日式醬油二次沉淀中90%以上的為蛋白質(zhì)[4]。

        由圖1b和圖1c可知,中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量隨著鐵離子(從約2.72 mg/mL至4.90 mg/mL)和沒(méi)食子酸(從約2.72 mg/mL至5.19 mg/mL)含量的升高而增加,其中Fe3+比Fe2+對(duì)中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量的影響更大。隨著鐵離子和沒(méi)食子酸添加量的增加,日式醬油幾乎未出現(xiàn)二次沉淀,說(shuō)明鐵離子和沒(méi)食子酸對(duì)日式醬油二次沉淀的生成量幾乎未產(chǎn)生影響。敏感蛋白和敏感多酚被認(rèn)為是黃酒產(chǎn)生二次沉淀的關(guān)鍵原因,其中敏感多酚和敏感蛋白在鐵離子的催化下形成的敏感蛋白-Fe3+/Fe2+-敏感多酚復(fù)合物是黃酒二次沉淀的主要成分[15]。上述研究結(jié)果表明中式高鹽稀態(tài)醬油中可能存在這類似的“敏感蛋白”和“敏感多酚”,兩者在醬油中鐵離子的催化作用下形成類似的“敏感蛋白-Fe3+/Fe2+-敏感多酚復(fù)合物”。

        圖1 影響醬油二次沉淀形成因素分析Fig.1 Analyses of factors affecting the secondary precipitate formation of soy sauce

        由圖1d和圖1e可知,中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量隨著大豆多糖(從約2.72 mg/mL至3.59 mg/mL)和大豆蛋白酶解物(從約2.72 mg/mL至4.68 mg/mL)含量的升高而增加,其中大豆蛋白酶解物比大豆多糖對(duì)中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量的影響更大。隨著大豆多糖添加量的增加,日式醬油幾乎未出現(xiàn)二次沉淀;而當(dāng)日式醬油中大豆蛋白酶解物添加量增加至4.5%時(shí),二次沉淀生成量明顯增加(0.84 mg/mL)。陳有容等[4]報(bào)道日本醬油二次沉淀由約90%的蛋白質(zhì)及少量的糖類物質(zhì)和NaCl組成;而中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀由20%~30%的蛋白質(zhì)、7%~26%的糖類物質(zhì)和35%~48%的NaCl組成[2]。Kikuchi等[16]和韓晴[17]研究認(rèn)為醬油中的糖類物質(zhì)來(lái)源于大豆細(xì)胞壁,是一類含大量半乳糖醛酸、鼠李二半乳糖醛酸、在酸性環(huán)境下帶負(fù)電荷、溶解度高且穩(wěn)定的酸性多糖。高獻(xiàn)禮等[3]分析了25種國(guó)內(nèi)外醬油糖類物質(zhì)含量,發(fā)現(xiàn)醬油糖類物質(zhì)平均含量約41.2 g/L,這與本研究結(jié)果基本一致。上述分析說(shuō)明醬油中大豆多糖不是醬油二次沉淀形成的直接原因。本團(tuán)隊(duì)前期研究揭示了大豆球蛋白G4蛋白中的B3亞基是中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀蛋白和醬油渣蛋白的主要成分,是導(dǎo)致中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成的主要成分[2,11]。本研究所使用的諾維信風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme為米曲霉產(chǎn)蛋白酶,用該酶制備的大豆蛋白酶解物同醬油中肽組成存在一定的相似性,存在一定量的大豆球蛋白B3亞基。因此,隨著大豆蛋白酶解物添加量的增加,不但中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量顯著增加,而且日式醬油二次沉淀生成量也顯著增加。

        由圖1f可知,隨著NaCl添加量的增加中式高鹽稀態(tài)醬油(從2.72 mg/mL至5.58 mg/mL)和日式醬油(從0 mg/mL至1.65 mg/mL)二次沉淀生成量均顯著增加,但在NaCl添加量相同的條件下中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量顯著高于日式醬油。常溫(20~25 ℃)下NaCl在水中達(dá)到飽時(shí)其濃度約為27%(m/m)。本研究中NaCl最大添加量15 g/100 mL(m/V),加上醬油中原有的NaCl,中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中NaCl最大含量分別為24.8%(m/m)和24.6%(m/m)(醬油密度按照1.15 g/mL計(jì)算),兩種醬油中NaCl均未達(dá)到飽和。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到NaCl添加量小于10 g/100 mL時(shí),中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量增加,瓶底未見過(guò)肉眼可見NaCl;NaCl添加量達(dá)到15 g/100 mL時(shí),二次沉淀含量顯著增加,且瓶底可見未溶解NaCl。NaCl添加量達(dá)到15 g/100 mL時(shí),日式醬油二次沉淀生成量顯著增加,但主要為未溶解的NaCl。NaCl含量的增加可能破壞了醬油體系中蛋白質(zhì)周圍水分子雙電層,導(dǎo)致相對(duì)穩(wěn)定的膠體體系被進(jìn)一步破壞,進(jìn)而生成了更多的二次沉淀。同時(shí),醬油系統(tǒng)內(nèi)豐富的有機(jī)物與NaCl競(jìng)爭(zhēng)水分子,引起NaCl飽和度下降,導(dǎo)致其在醬油體系中未達(dá)到理論飽和度即沉淀。

        如圖1g可知,乙醇在添加量在0.6%~1.8%范圍對(duì)中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油二次沉淀的生成均無(wú)顯著影響。傳統(tǒng)的中式高鹽稀態(tài)醬油在生產(chǎn)過(guò)程中不人為添加耐鹽乳酸菌和酵母菌,而日式醬油在醬醪發(fā)酵階段會(huì)人為添加耐鹽乳酸菌和酵母菌,兩種微生物可豐富和提高醬油香氣物質(zhì),以改善醬油風(fēng)味[18-20]。報(bào)道[21,22]顯示日式醬油中乙醇含量可達(dá)到1.5%~2%,而中式高鹽稀態(tài)醬油乙醇含量一般低于0.5%。乙醇可以使蛋白質(zhì)間正負(fù)電荷結(jié)合力增加,形成厭水性膠體,使蛋白質(zhì)和水間作用力降低,使敏感蛋白沉淀。本研究證明低濃度乙醇對(duì)醬油二次沉淀生成量無(wú)顯著影響。

        如圖1h可知,中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先下降(20 ℃)后顯著上升(60 ℃,3.94 mg/mL)的趨勢(shì)。日式醬油除了在60 ℃時(shí)生成少量二次沉淀之外,在-20~40 ℃均未見二次沉淀生成。上述結(jié)果說(shuō)明中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中二次沉淀成分存在差異。Tomita等[6]研究顯示日式醬油在60 ℃加熱殺菌過(guò)程中會(huì)形成谷氨酸丁酯,該酯可促進(jìn)日式醬油形成沉淀。這可能是兩種醬油在60 ℃儲(chǔ)存時(shí)二次沉淀顯著增加的原因之一。此外,加熱可加速醬油中分子運(yùn)動(dòng),增加分子之間碰撞的幾率,破壞原有相對(duì)穩(wěn)定的膠體體系,使二次沉淀生成量增加。

        2.3 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油游離氨基酸及疏水性分析

        由表2可知,除色氨酸之外,日式醬油游離氨基酸含量均高于中式高鹽稀態(tài)醬油。方差分析顯示日式醬油中有15種游離氨基酸含量顯著高于中式高鹽稀態(tài)醬油(p<0.01),兩種醬油中天門冬氨酸、半胱氨酸和色氨酸含量不存在顯著性差異(p>0.01)。日式醬油總游離氨基酸含量比中式高鹽稀態(tài)醬油高29.0%。谷氨酸、天門冬氨酸和亮氨酸是中式高鹽稀態(tài)醬油中含量最高的3種游離氨基酸,而谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸是日式醬油中含量最高的3種游離氨基酸。按照絕對(duì)含量計(jì)算,兩種醬油中游離氨基酸含量差異最大的分別為谷氨酸(2.39 mg/mL)、脯氨酸(1.64 mg/mL)和亮氨酸(1.30 mg/mL)。上述結(jié)果說(shuō)明中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中游離氨基酸組成存在顯著性差異。馮云子等[14]研究表明中式高鹽稀態(tài)醬油醬油和日式醬油在游離氨基酸組成上存在顯著性差異,中式高鹽稀態(tài)醬油醬油除了谷氨酸和色氨酸含量顯著高于日式醬油外,其他游離氨基酸含量均顯著低于日式醬油。中式高鹽稀態(tài)醬油在勾兌過(guò)程中人為添加谷氨酸鈉是造成中式高鹽稀態(tài)醬油谷氨酸含量高于日式醬油的原因。中式高鹽稀態(tài)醬油是以全大豆、面粉和食鹽為主要原料經(jīng)米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)而成[18,23],而日式醬油是以脫脂大豆、炒小麥和食鹽為原料經(jīng)米曲霉、乳酸菌和酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)而成[20]。脫脂大豆中蛋白質(zhì)含量顯著高于大豆,這可能是造成兩種醬油中游離氨基酸含量存在顯著差異的主要原因。

        前期研究發(fā)現(xiàn)中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀中不但含有25%左右的蛋白質(zhì),而且含有約0.15%的游離氨基酸[24]。前人研究認(rèn)為部分氨基酸的強(qiáng)疏水性是導(dǎo)致其在醬油中不穩(wěn)定的主要原因[1,24]。如表2所示,中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中游離氨基酸的平均疏水值分別為0.82和0.97,日式醬油中游離氨基酸的平均疏水值比中式高鹽稀態(tài)醬油高18.3%。如上所述,兩種醬油中游離氨基酸含量差異最大的分別為谷氨酸、脯氨酸和亮氨酸,這三種氨基酸的疏水值分別為0、2.60和1.80,說(shuō)明脯氨酸和亮氨酸是引起兩種醬油中游離氨基酸疏水值差異的主要貢獻(xiàn)者。令人意外的是,雖然日式醬油中游離氨基酸的疏水性顯著高于中式高鹽稀態(tài)醬油,但日式醬油二次沉淀中游離氨基酸含量極少,說(shuō)明強(qiáng)疏水性游離氨基酸可能不是引起中式高 鹽稀態(tài)醬油二次沉淀的主要原因。

        表2 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油游離氨基酸組成及其疏水值Table 2 Free amino acids composition and their hydrophobic values of Chinese-type high-salt and diluted-state soy sauce and Japanese-type soy sauce

        2.4 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油中大豆蛋白B3亞基分析

        圖2 中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油大豆中B3亞基分析Fig.2 Analysis of B3 subunit of soybean protein in Chinese-type high-salt and diluted-state soy sauce and Japanese-type soy sauce

        如圖2可知,中式高鹽稀態(tài)醬油中大豆球蛋白G4中B3亞基和G1中A1a亞基含量均顯著高于日式醬油,其中日式醬油中B3亞基被全部降解。大豆球蛋白G4蛋白中的B3亞基分別占中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀蛋白和醬油渣蛋白總量的76%和59%[11,25]。與大豆球蛋白中的其他酸性亞基相比(A1a、A1b、A2、A3、A4和A5),該B3亞基酸性氨基酸(Glu、Asp)含量低和疏水性氨基酸(Ala、Ile、Leu等)含量高,在強(qiáng)疏水力作用下(pH 4~7)可形成溶解度低的聚合物[26]。課題組前期研究證明該B3亞基二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲比例顯著低于醬油上清液蛋白中兩種二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例,而其α-螺旋比例顯著高于醬油上清液蛋白中α-螺旋比例[11]。Wang等[27]研究指出大豆蛋白中β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲比例與大豆蛋白溶解度高度正相關(guān)。因此,該B3亞基疏水性強(qiáng)導(dǎo)致其形成低溶解度的聚合物是導(dǎo)致B3亞基在醬油體系中不穩(wěn)定進(jìn)而形成沉淀的可能原因。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001236061.2)檢索到該B3亞基氨基酸序列(見圖3),并利用ExPASy對(duì)該亞基性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示該B3亞基是由165個(gè)氨基酸殘基組成的亞基,其分子量18195.22 u、pI為6.1。由于醬油中pH在5.5以下,因此,可以預(yù)測(cè)該B3亞基在醬油體系中帶正電荷。上述B3亞基含量的顯著差異可能是導(dǎo)致中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油二次沉淀含量的顯著差異的關(guān)鍵原因。

        中式高鹽稀態(tài)醬油和日式醬油的SDS-PAGE電泳圖結(jié)果說(shuō)明,日式醬油中蛋白質(zhì)降解程度較“徹底”,更多的蛋白質(zhì)被降解成小分子量寡肽和游離氨基酸,這與上述分析的兩種醬油中的游離氨基酸含量和氨基酸轉(zhuǎn)化率結(jié)果一致。

        圖3 B3亞基氨基酸殘基序列Fig.3 Amino acid sequence of B3 subunit

        3 結(jié)論

        綜合以上分析可知,pH、高溫及Fe3+/Fe2+、多酚、大豆多糖、大豆蛋白酶解物和NaCl含量對(duì)中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀的生成具有顯著影響。低濃度(<1.8%)的乙醇對(duì)醬油二次沉淀的生成無(wú)顯著影響。中式高鹽稀態(tài)醬油與日式醬油在蛋白質(zhì)(特別是B3亞基)組成上的顯著差異可能是導(dǎo)致兩種醬油二次沉淀生成量存在顯著差異的關(guān)鍵原因。中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成可能存在多種機(jī)制,其中之一可能為經(jīng)典的敏感蛋白-Fe3+/Fe2+-敏感多酚復(fù)合物途徑,其中大豆球蛋白G4蛋白中的B3亞基為敏感蛋白。此外,醬油中帶正電荷的不穩(wěn)定B3亞基與帶負(fù)電荷的大豆多糖在靜電引力作用下逐漸靠近、聚集,在此過(guò)程中大豆多糖空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使其更多親水性醛羧基團(tuán)暴露并與Na+通過(guò)靜電作用互相吸引,Na+屏蔽了大豆多糖親水性基團(tuán),最終形成了不穩(wěn)定的B3亞基-大豆多糖-Na+-Cl-復(fù)合物。該復(fù)合物逐漸聚集最終形成醬油二次沉淀,這是中式高鹽稀態(tài)醬油形成二次沉淀的另一可能途徑。在中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成的兩種可能途徑中大豆球蛋白G4蛋白中的B3亞基均扮演著關(guān)鍵作用,是中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成的關(guān)鍵物質(zhì)。因此,篩選可高效降解大豆球蛋白G4蛋白中B3亞基的安全微生物(或蛋白酶)將是本實(shí)驗(yàn)室的研究重點(diǎn)。

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