王昭鈺，王向坡，張萬(wàn)剛*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）（2.安徽綠微康生物科技有限公司，安徽池州 247100）

熏煮香腸是一類典型的傳統(tǒng)低溫肉制品，主要以畜禽肉為原料經(jīng)過(guò)腌制、斬拌等工序灌裝到腸衣中，經(jīng)熟制后形成特定的風(fēng)味和感官特性[1]。因其攜帶和食用方便、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。但在貯藏過(guò)程中熏煮香腸易發(fā)生氧化和受到微生物污染，從而造成品質(zhì)劣變并影響香腸的貨架期。

在肉制品加工過(guò)程中，食品添加劑可用于保持肉制品品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期。根據(jù)來(lái)源的不同食品保鮮劑分為化學(xué)合成、植物提取、微生物源等[2]?；瘜W(xué)合成的防腐和抗氧化劑具有較強(qiáng)的防腐、抗氧化功能，但對(duì)人體健康存在潛在危害，且消費(fèi)者接受度較低，因此尋找可替代的、安全可靠的食品添加劑是食品行業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)。近年來(lái)，微生物來(lái)源的防腐抗氧化劑因具有無(wú)毒、安全等特點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)。與化學(xué)添加劑相比，其具有安全、環(huán)保等特點(diǎn)；與動(dòng)植物源的食品添加劑相比，其具有生產(chǎn)效率高、成本低廉、設(shè)備簡(jiǎn)單、條件易控制等優(yōu)點(diǎn)，是極具市場(chǎng)潛力的食品添加劑種類。研究表明，丙酸等有機(jī)酸和乳酸鏈球菌素（Nisin）均具有良好的抗氧化和抑菌能力[3-5]。丙酸桿菌發(fā)酵提取物（Propionibacteriumfermented extract，PFE）是由產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸混合物，Nisin則是由乳酸乳球菌乳酸亞種發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種以多肽類物質(zhì)為主要成分的抑菌類物質(zhì)[4]。羅欣等[6]用含有丙酸鈣的保鮮液浸泡牛肉，發(fā)現(xiàn)丙酸鈣保鮮液可減緩鮮牛肉儲(chǔ)藏期間微生物的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的降解。劉啟蓮等[7]研究發(fā)現(xiàn)Nisin在酸性條件下活性較高，且隨著pH的升高，活性會(huì)逐漸下降。PFE可為Nisin提供適宜的酸性環(huán)境，從而更好保證其抑菌活性。閻永貞等[8]對(duì)比了不同防腐劑在西式火腿腸中的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，Nisin對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有良好的抑菌效果，而丙酸則對(duì)革蘭氏陰性菌具有良好的抑菌表現(xiàn)。目前，關(guān)于PFE和Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸產(chǎn)品品質(zhì)及貨架期影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)將PFE與Nisin復(fù)配加入到熏煮香腸中，研究PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸品質(zhì)、氧化程度及微生物的影響，從而為天然微生物添加劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PFE由安徽綠維康生物工程有限公司提供，主要功能成分：丙酸435.9 mg/g、琥珀酸22.21 mg/g、檸檬酸19.42 mg/g、乙酸13.29 mg/g和乳酸3.25 mg/g；Nisin由浙江新銀象生物工程有限公司提供；豬后腿瘦肉、豬背膘由江蘇省雨潤(rùn)食品集團(tuán)提供。

三氯乙酸（Trichloroacetic acid solution，TCA），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA），上海源葉生物科技有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（Plate count agar，PCA），北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MN-22S絞肉機(jī)，沈陽(yáng)厚地實(shí)業(yè)有限公司；BZBI-15斬拌機(jī)，嘉興市經(jīng)開(kāi)凱斯設(shè)備有限公司；SIM-F140AY65-PC制冰機(jī)，日本Panasonic公司；VF620真空灌腸機(jī)，德國(guó)Handtmann公司；Ti3000煙熏爐，德國(guó)Fessmann公司；Agilent 1100高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；MUL-9000XILIE系列純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；PD500-TP分散勻漿機(jī)，英國(guó)Prima公司；TW20通用水浴鍋，德國(guó)JULABO公司；Spectral Max M2e多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司；Avanti J-26S XP高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；SX-500高壓滅菌鍋，日本Tomy公司；CR-400便攜式色差儀，日本Konica Minolta公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stab Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 熏煮香腸的制作

基本配方：豬后腿肉與豬背膘的質(zhì)量比為4:1，冰水添加量為豬后腿肉與豬背膘總質(zhì)量的20%，食鹽添加量為豬肉總質(zhì)量的2%，三聚磷酸鹽、雞精和白胡椒粉的添加量均為豬肉總重的0.4%。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（由上述基本配方制成）和五個(gè)處理組（C：對(duì)照組；T1：0.3% PFE復(fù)配0.01% Nisin；T2：0.3% PFE復(fù)配0.02% Nisin；T3：0.3% PFE復(fù)配0.03% Nisin；T4：?jiǎn)为?dú)添加0.3% PFE；T5：?jiǎn)为?dú)添加0.03% Nisin）。

工藝流程：去除豬后腿肉的可見(jiàn)筋膜，用4 mm孔板將豬后腿肉和豬背膘絞碎，按照4:1的比例混合后，加入配料后用斬拌機(jī)（1400 r/min，60 s）充分?jǐn)匕璩扇饷?。整個(gè)斬拌過(guò)程中，混合肉糜的溫度不超過(guò)12 ℃。將肉糜灌入直徑為25 mm膠原蛋白腸衣中，將香腸置于煙熏爐中經(jīng)過(guò)干燥排氣后煙熏（65 ℃～68 ℃，60 min），再經(jīng)過(guò)水汽蒸煮至中心溫度為72 ℃，冷卻至室溫后置于托盤中放于4 ℃冷庫(kù)中貯藏，并在貯藏期間測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 顏色的測(cè)定

參照Moroney等[9]的方法并稍作改動(dòng)。將香腸樣品用雙面切刀切成相同高度的圓柱體，先將色差儀用標(biāo)準(zhǔn)板進(jìn)行校正（Y=94.0，x=0.3156，y=0.3321），然后采用D65光源、8 mm測(cè)量直徑范圍及2 °視角對(duì)香腸橫截面的L*（亮度）、a*（紅度）、b*（黃度）值進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

參考Wu等[10]的方法并稍作修改。將香腸樣品用1 cm厚雙面切刀和圓柱形取樣器制成高1 cm、直徑為1 cm的圓柱體，選取硬度（Hardness）、彈性（Springiness）、咀嚼性（Chewiness）和回復(fù)性（Resilience）4個(gè)質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)來(lái)表征熏煮香腸的質(zhì)構(gòu)變化。選取P50探頭，測(cè)定參數(shù)如下：測(cè)定前探頭速度：2.00 mm/s；測(cè)定后探頭速度：1.00 mm/s；兩次測(cè)定時(shí)間間隔：5.00 s；測(cè)定壓縮比：50%；測(cè)定完成后通過(guò)儀器自帶軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.4 硫代巴比妥酸值（Thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）的測(cè)定

參考Zhang等[11]的方法并略作改動(dòng)。稱取2 g碎肉于離心管中，加入10 mL 7.5%的三氯乙酸溶液，冰浴勻漿2次（12000 r/min，20 s/次），勻漿液于4 ℃和12000 r/min離心5 min，取2 mL上清加入2 mL 2-硫代巴比妥酸溶液（0.02 mol/L），95 ℃水浴加熱30 min。冷卻至室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)量上清液在532 nm的吸光值，同時(shí)以三氯乙酸加2-硫代巴比妥酸溶液作空白對(duì)照。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。TBARS值以每1 kg肉樣中所含丙二醛的量（mg/kg）來(lái)表示。

1.3.5 菌落總數(shù)的測(cè)定

按照GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.3.6 DNA提取及高通量測(cè)序

DNA提取參考Yang等[13]的方法，取相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的樣品，提取細(xì)菌總DNA后，通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并通過(guò)紫外分光光度計(jì)定量。采用由上海凌恩生物公司提供的方法，對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò) 增，擴(kuò) 增 引 物 為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：98 ℃預(yù)變性2 min；進(jìn)入熱循環(huán)，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25～30個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)延伸為72 ℃、5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)AgencourtAMPure Beads純化，由Qubit 3.0熒光計(jì)定量，再通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，字母不同表示差異顯著（p＜0.05）。測(cè)序數(shù)據(jù)參考Xue等[14]的方法，通過(guò)定量微生物生態(tài)軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，QIIME）在97%的置信水平下進(jìn)行OTU聚類和后續(xù)生物分析。通過(guò)QIIME和R軟件對(duì)Alpha多樣性（包括覆蓋度、Shannon和Chaos1指數(shù)）進(jìn)行分析。使用可視化工具GraPhlAn繪制分類等級(jí)樹(shù)以快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群。用R軟件進(jìn)行聚類分析繪制熱圖，以二維圖像描述樣本間的自然分布特征。

2 結(jié)果與討論

2.1 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸顏色的影響

由表1可以看出，在整個(gè)貯藏期內(nèi)，復(fù)配組的L*值顯著高于單獨(dú)添加Nisin的處理組（p＜0.05），在前7 d，單獨(dú)添加PFE的樣品L*值均顯著高于空白對(duì)照組（p＜0.05）。研究顯示肉制品的亮度與水分含量呈顯著正相關(guān)，Lawrence等[15]發(fā)現(xiàn)乳酸鹽可提高牛肉的持水性，這主要是因?yàn)橛袡C(jī)酸鹽增強(qiáng)了肉中的離子強(qiáng)度，使蛋白發(fā)生溶脹，進(jìn)而使保水性增加。因此復(fù)配后香腸亮度值的上升主要與PFE中含有的丙酸鹽、乳酸鹽等有機(jī)酸鹽提高香腸的保水性有關(guān)。在第10 d，復(fù)配0.01% Nisin的亮度值顯著高于其它處理組（p＜0.05），說(shuō)明該復(fù)配比例有助于提高香腸的亮度，保持香腸的色澤。

在貯藏的第1和7 d，復(fù)配組的a*值顯著高于單獨(dú)添加PFE的處理組（p＜0.05），說(shuō)明復(fù)配可提高熏煮香腸的紅度值；與1 d相比，各試驗(yàn)組的a*值在第4 d均顯著降低（p＜0.05），但當(dāng)貯藏時(shí)間延長(zhǎng)到第10 d時(shí)，復(fù)配組的a*值均顯著上升（p＜0.05），而單獨(dú)添加Nisin的處理組和對(duì)照組的紅度值則無(wú)顯著差異（p＞0.05）。紅度值主要受肉品中肌紅蛋白影響，肌紅蛋白被氧化為褐色的高鐵肌紅蛋白后會(huì)使肉制品的紅度值降低。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)乳酸鹽具有較高的抗氧化能力，能提高牛肉肌紅蛋白的還原活性，保持肉色穩(wěn)定。復(fù)配組紅度值升高原因可能是復(fù)配處理可以更好地抑制肌紅蛋白的氧化，以上結(jié)果與侯芹等[17]在花椒提取物對(duì)調(diào)理豬肉餅貯藏期間品質(zhì)的影響中報(bào)道一致。

在貯藏前期（1～4 d），除了復(fù)配0.02% Nisin的b*值無(wú)顯著變化外，對(duì)照組和其它處理組均顯著上升（p＜0.05）；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)配0.01% Nisin的b*值顯著降低（p＜0.05）。結(jié)果表明，PFE復(fù)配Nisin后顯著抑制了黃度值的上升。陳洪生等[18]發(fā)現(xiàn)，在肉餅中加入丁香提取物可以降低脂肪氧化程度，導(dǎo)致黃度值下降，據(jù)此推測(cè)復(fù)配處理能更好地抑制脂肪氧化，降低香腸的黃度值。

表1 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸顏色的影響Table 1 Effects of PFE-nisin combination on the color of smoked and cooked sausages

2.2 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸質(zhì)構(gòu)的影響

由表2可知，單獨(dú)添加PFE的硬度均顯著低于單獨(dú)添加Nisin的處理組（p＜0.05）；在第4～7 d，復(fù)配0.01%和0.02% Nisin的硬度均顯著小于對(duì)照組和單獨(dú)添加Nisin的處理組，說(shuō)明復(fù)配可降低熏煮香腸的硬度。肉制品的硬度與其含水量呈反比關(guān)系，許多研究表明乳酸鹽、磷酸鹽等有機(jī)酸鹽可以改變蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、增加凝膠強(qiáng)度來(lái)提高肉制品的保水性[19,20]。Meltwm等[21]研究檸檬酸對(duì)肉制品食用品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)檸檬酸具有明顯的嫩化作用。Berge等[22]發(fā)現(xiàn)注射乳酸可以降低牛肉的韌性，增加其嫩度。由此推測(cè)復(fù)配后熏煮香腸硬度的下降與PFE中的有機(jī)酸及其鹽有關(guān)。此外，在貯藏期間，只有復(fù)配0.01% Nisin的香腸硬度未發(fā)生顯著性變化，表明該復(fù)配比例能更好地保持香腸硬度的穩(wěn)定。

在第7～10 d，復(fù)配0.01%和0.02% Nisin處理組的彈性均顯著低于單獨(dú)添加Nisin的處理組（p＜0.05），說(shuō)明復(fù)配會(huì)降低香腸的彈性。吳雪燕等[23]對(duì)中式香腸的研究發(fā)現(xiàn)蛋白氧化程度與產(chǎn)品的彈性呈正相關(guān)，這主要是因?yàn)榈鞍籽趸纬啥蜴I，增加肌原纖維結(jié)構(gòu)的韌性，從而使彈性上升。因此復(fù)配組彈性的下降的主要原因可能是復(fù)配處理可抑制蛋白氧化，降低肌原蛋白的交聯(lián)進(jìn)而抑制彈性的上升。在整個(gè)貯藏期間，不同復(fù)配比例的處理組間彈性無(wú)顯著差異，說(shuō)明不同復(fù)配比例對(duì)香腸的彈性影響不顯著。

如表2所示，在第4和10 d，復(fù)配組的咀嚼性顯著低于單獨(dú)添加Nisin的處理組（p＜0.05）；且在整個(gè)貯藏期內(nèi)，單獨(dú)添加PFE的咀嚼性均小于單獨(dú)添加Nisin的處理組（p＜0.05）。Mohammad等[24]研究表明香腸的咀嚼性與硬度呈顯著正相關(guān)，故復(fù)配組咀嚼性的降低與其硬度的降低有關(guān)。在貯藏期間，復(fù)配0.02% Nisin的處理組的咀嚼性波動(dòng)顯著（p＜0.05），而其它復(fù)配比例的咀嚼性均未發(fā)生顯著性變化，說(shuō)明0.02%的復(fù)配比例不利于熏煮香腸咀嚼性的穩(wěn)定。

在貯藏過(guò)程中，除第1 d外，單獨(dú)添加Nisin的回復(fù)性均顯著高于其它處理組（p＜0.05）；在第7 d，復(fù)配0.02%和0.03% Nisin的回復(fù)性顯著高于單獨(dú)添加PFE的處理組（p＜0.05），說(shuō)明加入Nisin可提高香腸的回復(fù)性。除第7 d外，復(fù)配組間的回復(fù)性均無(wú)顯著差異，說(shuō)明不同復(fù)配比例對(duì)香腸的回復(fù)性影響不顯著。質(zhì)構(gòu)特性是評(píng)價(jià)肉制品品質(zhì)和感官特性的重要指標(biāo)，其與產(chǎn)品的水分、脂肪氧化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等多種因素有關(guān)[25]。綜合以上研究結(jié)果可知，PFE復(fù)配一定比例的Nisin使香腸軟硬適中，有利于熏煮香腸貯藏期間質(zhì)構(gòu)特性的穩(wěn)定。

表2 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effects of PFE-nisin combination on the textural characteristics of smoked and cooked sausages

2.3 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸脂肪氧化的影響

脂肪過(guò)度氧化是導(dǎo)致肉制品品質(zhì)劣變的重要原因之一，氧化產(chǎn)生的不良風(fēng)味會(huì)使肉制品感官發(fā)生改變，造成感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生某些有毒的醛類、酮類等危害消費(fèi)者健康[26,27]。肉制品的脂肪氧化程度主要用TBARS值來(lái)表示，PFE與Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸貯藏期間TBARS值的影響如圖1所示。由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，處理組的TBARS值均顯著降低（p＜0.05），說(shuō)明Nisin和PFE均可抑制脂肪氧化。在貯藏前期（1～4 d），復(fù)配0.01%和0.02% Nisin的TBARS值均顯著低于單獨(dú)添加PFE的處理組，而復(fù)配0.03% Nisin時(shí)則與單獨(dú)添加PFE無(wú)顯著差異，說(shuō)明復(fù)配低濃度的Nisin能顯著提高抗氧化效果。磨佳琳等[28]研究發(fā)現(xiàn)，隨著加入Nisin濃度的升高豬肉的TBARS值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，說(shuō)明Nisin的濃度過(guò)高時(shí)反而不利于抑制脂肪氧化。宋萌等[29]發(fā)現(xiàn)，Nisin與乳酸、乳酸鈉和殼聚糖復(fù)配對(duì)冷卻豬肉的保鮮具有良好的協(xié)同作用，且最佳復(fù)配比例為250 mg/L Nisin+0.25%殼聚糖+1%乳酸鈉+1%乳酸。趙敏等[30]指出，Nisin協(xié)同0.5%乳酸對(duì)冷卻豬肉的脂質(zhì)氧化抑制作用有效果。研究表明，Nisin在低pH條件下活性最高，隨著pH的上升其活性逐漸降低，故PFE與Nisin產(chǎn)生協(xié)同作用的主要原因?yàn)镻FE中的丙酸、乳酸等有機(jī)酸為Nisin提供了適宜的酸性環(huán)境，從而保證了良好的保鮮效果。

圖1 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸TBARS值的影響Fig.1 Effects of PFE-nisin combination on TBARS values of smoked and cooked sausages

2.4 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸菌落總數(shù)的影響

為探究復(fù)配對(duì)貨架期的影響，本研究將熏煮香腸的貯藏周期延長(zhǎng)至28 d，觀察貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化。由表3可知，與空白組相比，處理組的菌落總數(shù)顯著降低（p＜0.05），說(shuō)明添加劑在整個(gè)貯藏期間表現(xiàn)出了良好的抑菌效果。Taylor等[31]研究表明，丙酸鹽釋放的丙酸可抑制酶的活性，進(jìn)而達(dá)到抑菌效果。呂淑霞等[32]發(fā)現(xiàn)，Nisin通過(guò)吸附在微生物的細(xì)胞膜上來(lái)破壞細(xì)胞膜的完整性，引起微生物細(xì)胞的裂解和死亡。此外，復(fù)配組的菌落總數(shù)均顯著小于單獨(dú)添加的處理組（p＜0.05），說(shuō)明復(fù)配處理能顯著提高產(chǎn)品的抑菌能力，延長(zhǎng)香腸的保質(zhì)期。羅嬋[33]研究發(fā)現(xiàn)，Nisin與檸檬酸復(fù)配對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出協(xié)同抑菌效果；顧仁勇等[34]利用響應(yīng)面法優(yōu)化臘肉的復(fù)配防腐劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，Nisin和檸檬酸、雙乙酸鈉存在協(xié)同增效作用，且最佳復(fù)配比例為：檸檬酸1.20 g/kg、雙乙酸鈉0.97 g/kg、Nisin 0.16 g/kg。在貯藏后期（21～28 d），復(fù)配0.01% Nisin的菌落總數(shù)顯著低于其它復(fù)配組（p＜0.05)；在第28 d，復(fù)配0.02%和0.03% Nisin的菌落總數(shù)已經(jīng)超過(guò)GB 2726-2016[35]中熟肉制品菌落總數(shù)的最高安全限量值5 lg(CFU/g)，說(shuō)明香腸已經(jīng)發(fā)生腐敗變質(zhì)，而復(fù)配0.01% Nisin的處理組仍處于安全標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明0.01%復(fù)配比例的防腐效果更好。李茹等[36]在優(yōu)化復(fù)合生物保鮮劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)茶多酚濃度一定時(shí)，隨著Nisin濃度的增大，復(fù)配后的抑菌率先增大后減小，當(dāng)復(fù)配Nisin的濃度過(guò)高時(shí)協(xié)同作用會(huì)降低。微生物的生長(zhǎng)繁殖是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的主要原因，在食品的低溫貯藏過(guò)程中（0～4 ℃），微生物的活動(dòng)并沒(méi)有被完全抑制，仍然影響食品的品質(zhì)，添加天然高效的抑菌劑對(duì)延長(zhǎng)肉制品的保質(zhì)期和貨架期至關(guān)重要。

表3 PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸菌落總數(shù)[lg(CFU/g)]的影響Table 3 Effects of PFE-nisin combination on the total bacterial counts of smoked and cooked sausages

2.5 熏煮香腸的微生物多樣性分析

表4 貯藏期間熏煮香腸的菌群豐度和多樣性Table 4 Species richness and diversity of smoked and cooked sausages during storage

由表4可知，空白對(duì)照組和五個(gè)處理組的平均有效序列標(biāo)簽分別為37905、34136、43644、37015、36319和45275個(gè)。不同處理組中所含微生物種類存在差異，表明不同處理的熏煮香腸在貯藏期間的微生物菌群結(jié)構(gòu)平衡和多樣性存在差異。所有處理組的Chaos 1與Shannon均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，表明熏煮香腸中的菌群多樣性呈先下降后上升的趨勢(shì)。在貯藏前期，加入的添加劑對(duì)微生物的豐度產(chǎn)生了明顯的抑制作用，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用逐漸減弱，導(dǎo)致貯藏后期微生物豐度值的上升。所有樣品的測(cè)序覆蓋度均在99%以上，說(shuō)明香腸中主要的微生物均被檢測(cè)，本數(shù)據(jù)可反映樣品中的微生物多樣性。

2.6 熏煮香腸的微生物菌群結(jié)構(gòu)變化

圖2為貯藏28 d內(nèi)添加劑復(fù)配對(duì)熏煮香腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。在貯藏初期，不同處理組的微生物結(jié)構(gòu)較為相似，主要的優(yōu)勢(shì)菌群有不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、水桿菌屬（Hydrobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等。在貯藏的第14 d，不同處理組的微生物結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異，除單獨(dú)添加Nisin的處理組外，其它處理組勞爾氏菌屬（Ralstonia）的相對(duì)豐度急劇上升，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群；而單獨(dú)添加Nisin的處理組的優(yōu)勢(shì)菌群為不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬、分支桿菌屬（Mycobacterium）和冢村氏菌屬（Tsukamurella）。同時(shí)，單獨(dú)添加PFE的處理組的葉桿菌屬（Phyllobacterium）和中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）的比例上升，成為優(yōu)勢(shì)菌群。在貯藏后期，復(fù)配組和單獨(dú)添加Nisin的菌群結(jié)構(gòu)相似，優(yōu)勢(shì)菌群為水桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬和假單胞菌屬；單獨(dú)添加PFE的處理組中，葡萄球菌屬（Staphylococcus）的相對(duì)含量上升，成為優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)，對(duì)照組的芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）的相對(duì)豐度升高，成為優(yōu)勢(shì)菌群，推測(cè)其可能是導(dǎo)致對(duì)照組香腸腐敗的主要微生物。

研究表明，Nisin對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果較好，而丙酸及其鹽類則對(duì)革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的抑制能力[37,38]。在貯藏的中后期，復(fù)配組比單獨(dú)添加Nisin的處理組對(duì)不動(dòng)桿菌屬（G-）表現(xiàn)出更好的抑菌效果；而與單獨(dú)添加PFE相比，復(fù)配組則對(duì)葡萄球菌屬（G+）具有更好的抑菌效果，說(shuō)明復(fù)配能擴(kuò)大產(chǎn)品的抑菌譜，延長(zhǎng)香腸的保質(zhì)期。不動(dòng)桿菌屬是一類專性需氧的革蘭氏陰性菌，張秋勤等[39]對(duì)生鮮雞中的腐敗菌分析后發(fā)現(xiàn)，在貯藏前期和后期的優(yōu)勢(shì)菌群都包含不動(dòng)桿菌屬，是貯藏過(guò)程中主要的致腐菌。葡萄球菌屬屬于需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，是肉制品中常見(jiàn)的腐敗菌，其中金黃色葡萄球菌是引起食物中毒的主要微生物之一。

本研究采用熱圖分析進(jìn)一步探究了不同處理的香腸在貯藏期間菌群結(jié)構(gòu)的變化及差異，結(jié)果如圖3所示，其中紅色表示豐度較高，而藍(lán)色表示豐度較低。由熱圖的顏色變化可知，在第14 d時(shí)，各處理組的相對(duì)豐度均相對(duì)較低，菌群豐度值隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這與2.5中菌群豐度和多樣性的結(jié)果一致。在貯藏的前期和中期（1～14 d），不同的處理組根據(jù)時(shí)間分別聚類，同一時(shí)間的不同處理組的菌群結(jié)構(gòu)相似。但到貯藏后期（28 d），復(fù)配0.01% Nisin的處理組菌群?jiǎn)为?dú)聚類，說(shuō)明在貯藏后期其與其它處理組的菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異，且菌群豐度顯著低于其它試驗(yàn)組。相較于其它復(fù)配比例，復(fù)配0.01%的Nisin對(duì)分支桿菌屬和弧菌屬（Vibrionimonas）表現(xiàn)出更好的抑制作用。Salo等[40]對(duì)牛奶中的微生物鑒定發(fā)現(xiàn)牛奶生產(chǎn)加工過(guò)程中易受到分支桿菌屬的污染，導(dǎo)致牛奶的腐敗。Duan等[41]分析了不同貯藏溫度下羅非魚(yú)片的微生物構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)在0 ℃和-3 ℃條件下的優(yōu)勢(shì)菌群中都發(fā)現(xiàn)了弧菌屬，是羅非魚(yú)片低溫貯藏過(guò)程中主要的腐敗菌。結(jié)合菌落總數(shù)的結(jié)果可以得知0.01%的復(fù)配比例對(duì)微生物的數(shù)量和種類都能起到更好的抑制作用。

圖2 貯藏期間熏煮香腸微生物群落的相對(duì)豐度（屬水平）Fig.2 Relative abundance of bacterial community in smoked and cooked sausages during storage (at genus level)

圖3 貯藏期間熏煮香腸微生物群落的熱圖分析Fig.3 Heatmap of bacterial community in smoked and cooked sausages during storage

3 結(jié)論

本文通過(guò)分析產(chǎn)品品質(zhì)和脂肪氧化及微生物等指標(biāo)研究了PFE-Nisin復(fù)配對(duì)熏煮香腸貯藏期間品質(zhì)的影響。PFE復(fù)配Nisin可提高香腸貯藏期間L*值和a*值，降低b*值；同時(shí)可顯著降低香腸的硬度和咀嚼性，提高產(chǎn)品的彈性。在貯藏的第1～4 d，復(fù)配0.01%和0.02% Nisin的TBARS值顯著低于單獨(dú)添加Nisin和PFE的處理組；復(fù)配處理組的菌落總數(shù)在整個(gè)貯藏期間均顯著小于單獨(dú)添加的處理組，且0.01% Nisin復(fù)配組在貯藏后期菌落總數(shù)最低，貨架期顯著延長(zhǎng)。通過(guò)分析微生物的多樣性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)配添加劑對(duì)熏煮香腸貯藏期間的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響。在貯藏初期，不同處理組的菌群結(jié)構(gòu)相似，但在貯藏的中后期，復(fù)配處理對(duì)不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬和芽孢八疊球菌屬等表現(xiàn)出更好的抑制作用，擴(kuò)大了抑菌范圍。綜上可知，PFE復(fù)配Nisin后可有效抑制熏煮香腸微生物菌群的多樣性，抑制微生物的生長(zhǎng)和脂肪氧化，更好的保障熏煮香腸在貯藏期間的品質(zhì)，其中0.01%的Nisin復(fù)配比例綜合表現(xiàn)良好。