李一峰，朱毅，梁雪瑩，李偉，符姜燕，扈圓舒，蔡惠鈿，彭名軍，曹庸*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）（2.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東中山 528437）（3.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510410）

大豆異黃酮為12種大豆天然異黃酮的統(tǒng)稱，是一類多酚化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與17β-雌二醇類似，又被稱為植物雌激素[1]。大豆異黃酮分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷，自然界中大豆異黃酮主要以結(jié)合型糖苷的形式存在，但人體吸收游離型苷元的能力更強(qiáng)，所以游離型苷元更能發(fā)揮其生物活性[2]。染料木素作為大豆中游離型苷元的主要成分，其具有抗氧化、治療糖尿病[3]、抗阿茲海默氏病[4]、治療更年期綜合癥[5]、抗腫瘤[6]、神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)免疫[7]等作用。染料木素作為天然產(chǎn)物，原料易得、毒副作用小等特點(diǎn)也為它帶來(lái)了巨大的市場(chǎng)潛力。

醬油發(fā)酵基料是大豆經(jīng)過(guò)發(fā)酵后剩余的基料，產(chǎn)量大，價(jià)格低，含有油脂、蛋白等多種營(yíng)養(yǎng)成分。大豆異黃酮、膳食纖維、低聚糖等活性物質(zhì)的存在，使醬油發(fā)酵基料的回收利用成為熱門話題[8]。原大豆異黃酮主要是以糖苷形式（97%～99%）存在，苷元（大豆苷元、染料木素和黃豆黃素）含量少（1%～3%），糖苷需降解為苷元才能夠被小腸吸收。大豆經(jīng)過(guò)醬油發(fā)酵，苷元含量大幅提高，由于游離型苷元難溶于水，其大部分殘留在醬油發(fā)酵基料中[9]。研究表明，染料木素在醬油發(fā)酵基料中剩余率可達(dá)到95%[10]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans），有雌雄同體或雄體兩種性別，雌雄同體具有959個(gè)不變的體細(xì)胞。雖然秀麗線蟲(chóng)體型微小，但其具有比較完整的生理系統(tǒng)，如神經(jīng)、性腺、咽腺、肌肉以及免疫等系統(tǒng)。83%秀麗隱桿線蟲(chóng)蛋白質(zhì)組被預(yù)測(cè)為具有人同源性，線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物之間高度保守的基本生物分子和細(xì)胞信號(hào)通路，例如胰島素信號(hào)通路、先天免疫調(diào)節(jié)通路、突觸機(jī)制和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)所涉及的系統(tǒng)[11]。秀麗線蟲(chóng)本身具有微量、生長(zhǎng)周期短、后代數(shù)量巨大、通體透明易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，因此成為科學(xué)研究中被共同認(rèn)可的生物模型之一。秀麗隱桿線蟲(chóng)已被廣泛運(yùn)用于抗衰老[12]、減肥[13]和生殖毒性[14]等活性研究。

適量的天然活性物對(duì)動(dòng)物的抗氧化、生長(zhǎng)和繁殖性能起一定的促進(jìn)作用，但高劑量的天然活性物可能會(huì)對(duì)動(dòng)物的機(jī)體性能產(chǎn)生抑制作用。“權(quán)衡”機(jī)制宣稱延長(zhǎng)壽命將以減少或喪失生殖能力為代價(jià)[15]。畜禽業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，使染料木素等植物雌激素被廣泛應(yīng)用于飼料中，但有學(xué)者指出，長(zhǎng)期使用植物雌激素可能造成動(dòng)物機(jī)體內(nèi)分泌紊亂，從而對(duì)家畜的生理機(jī)能造成損害[1]?？寡趸镔|(zhì)大多具有清除生物體內(nèi)自由基、激活體內(nèi)防御酶體系能力，從而達(dá)到延緩機(jī)體衰老的目的，植物多酚攝入機(jī)體后具有很強(qiáng)的抗氧化能力，但是否會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生有害作用，也是人們研究的重點(diǎn)。因此染料木素的安全使用量及功能活性備受關(guān)注。本研究以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型，通過(guò)測(cè)定線蟲(chóng)壽命、生殖能力、運(yùn)動(dòng)能力、熱應(yīng)激、體內(nèi)抗氧化酶活力等指標(biāo)，研究染料木素對(duì)線蟲(chóng)健康壽命的影響，并找出合理、經(jīng)濟(jì)添加量，以期為染料木素作為天然抗氧化劑的推廣應(yīng)用供理論依據(jù)和發(fā)展思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油發(fā)酵基料由海天調(diào)味食品股份有限公司提供，存放在4 ℃冰箱中，染料木素標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%）購(gòu)買于上海源葉生物科技有限公司。

無(wú)水乙醇、三氯乙酸、30% H2O2、水楊酸等，分析純，購(gòu)于天津市永大化學(xué)試劑有限公司；HCl（分析純），購(gòu)于重慶川東化工有限公司；菲啰嗪一鈉鹽、DPPH自由基，購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；鄰苯三酚、NaOH、FeSO4等購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；MDA、CAT、SOD、GSH等試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104萬(wàn)分之一電子天平，Mettler；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LDZX-40B型立式自控電熱蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SMZ-T4連續(xù)變倍體視顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；SWCJ-A超凈工作臺(tái)，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；En Spire酶標(biāo)儀，Perkin Elmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

醬油發(fā)酵基料中大豆異黃酮的提?。?00 g醬油發(fā)酵基料（精準(zhǔn)稱量至0.01 g）于5 L燒杯中、用固液比1:10條件下加入蒸餾水脫鹽，離心去掉上清，沉淀中加入85%乙醇磁力攪拌30 min，萃取三次，合并上清后濃縮，濃縮后加入適量石油醚脫油，烘干。

染料木素的純化：硅膠經(jīng)烘干預(yù)處理后濕法裝入層析柱（2.0 cm×50 cm）中，壓緊。準(zhǔn)確稱取一定量的大豆異黃酮提取物粗提物溶解于少量的甲醇后與少量硅膠混勻，加到柱上方，用洗脫劑進(jìn)行解析，將含有染料木素的洗脫液合并蒸干，將柱層析產(chǎn)物溶于熱的60%乙醇中，冷卻，過(guò)濾。55 ℃真空干燥得到淺黃色染料木素結(jié)晶。將樣品進(jìn)行高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測(cè)。

染料木素標(biāo)準(zhǔn)品：稱量10 mg染料木素，用85%乙醇定容至10 mL容量瓶，配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別吸取100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用85%乙醇稀釋定容到10 mL容量瓶。

色譜條件：色譜柱為Agelapromosil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫36 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為0.1%乙酸水溶液和乙腈（B泵）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm（UV）；乙腈濃度為10%～85%。

1.3.2 染料木素體外抗氧化活性研究

1.3.2.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)

將0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL濃度染料木素溶液以1:3的體積比與0.5 mmol/L的1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)-甲醇溶液混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)三次[16]。

1.3.2.2 ABTS自由基清除試驗(yàn)

將38.4 mg的2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS）中加入2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液，在23 ℃下暗處反應(yīng)12～16 h，得到ABTS自由基，用PBS緩沖液稀釋，使溶液在734 nm下的吸光值在0.7±0.02之間，將0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL濃度染料木素溶液以1:1的體積比與ABTS溶液混合，37 ℃中保溫10 min，測(cè)定734 nm下的吸光值，重復(fù)三次[17]。以甲醇為空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

配備0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL濃度染料木素溶液，取0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液120 μL于96孔板中，分別加入40 μL樣液和25 mmol/L鄰苯三酚溶液20 μL，震蕩搖勻5 min后加入8 mol/L HCl溶液20 μL終止反應(yīng)，在325 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值，重復(fù)三次[17]。

1.3.2.4 羥基自由基清除試驗(yàn)

取0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL濃度染料木素溶液20 μL，分別加入3 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和9 mmol/L H2O2溶液60 μL，37 ℃避光反應(yīng)30 min，在510 nm處檢測(cè)吸光值，重復(fù)三次[18]。以甲醇為空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.3 染料木素對(duì)秀麗隱苷線蟲(chóng)抗氧化活性的影響

1.3.3.1 培養(yǎng)基的制備

三角瓶中分別加入NaCl、瓊脂、胰蛋白胨，加水定容到1 L，搖勻后121 ℃滅菌30 min。冷卻后分別加入1 mL滅菌后的CaCl2、MgSO4和膽固醇溶液，再加入25 mL磷酸鉀緩沖液，搖勻后趁熱倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)10 mL。

1.3.3.2 線蟲(chóng)的培養(yǎng)與同期化

將大腸桿菌菌株OP50涂到培養(yǎng)基中，菌液晾干后接種線蟲(chóng)，在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將NaOH和高氯酸鈉混勻作為裂解液，緩沖液將培養(yǎng)皿上的卵和體內(nèi)有卵的線蟲(chóng)一起沖洗至離心管中，去掉上清，加入裂解液，至蟲(chóng)體裂解后3000 r/min離心30 s，將蟲(chóng)卵打到樣品板中。

1.3.3.3 壽命實(shí)驗(yàn)

將同期化的野生型線蟲(chóng)，隨機(jī)挑取60條至給藥組（50、100、200 μmol/L染料木素）與對(duì)照組，20 ℃下培養(yǎng)，每24 h將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿內(nèi)，并觀察線蟲(chóng)的存活情況。每天記錄存活、死亡、失蹤和異常的蟲(chóng)子數(shù)量[19]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.3.4 熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

將同期化L4期的N2線蟲(chóng)，放置在35 ℃的培養(yǎng)箱中[20]，此時(shí)設(shè)為0 h，每1 h記錄線蟲(chóng)的存活情況，至全部死亡，每組3個(gè)平行，每個(gè)培養(yǎng)皿60條線蟲(chóng)。

1.3.3.5 運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)挑選50條經(jīng)過(guò)同期化的線蟲(chóng)，在第5、10、15 d隨機(jī)挑取10條線蟲(chóng)觀察同等時(shí)間內(nèi)頭擺運(yùn)動(dòng)、正弦運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)能力，記錄標(biāo)準(zhǔn)：A：自發(fā)運(yùn)動(dòng)；B：觸碰后可以運(yùn)動(dòng)；C：觸碰后頭尾輕微運(yùn)動(dòng)。

1.3.3.6 產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)

將同期化L4期的N線蟲(chóng)，隨機(jī)挑取2條至加藥組與空白對(duì)照組，每組5個(gè)培養(yǎng)皿，每24 h把蟲(chóng)子轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，記錄蟲(chóng)子每天的產(chǎn)卵量。

1.3.3.7 抗氧化指標(biāo)

將同期化L4期的N2線蟲(chóng)，破碎后離心，取上清液，用試劑盒檢測(cè)過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平。

1.3.3.8 活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）自由基測(cè)定

經(jīng)染料木素培養(yǎng)96 h后，M9緩沖液清洗去除大腸桿菌，用鉑金絲挑取50條線蟲(chóng)，轉(zhuǎn)移到96孔板中，加入熒光探針H2DCF-DA[21]，在發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，每組重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過(guò)SPSS 23.0軟件采用單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05則為顯著差異。其中，柱狀圖、生存曲線使用GraphPad（ANOVA）（mac 6.00版）軟件進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC檢測(cè)染料木素體外抗氧化活性的測(cè)定

圖1 染料木素單體HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of genistein monomer

表1 不同樣品染料木素含量和得率Table 1 Genistein content and recovery rate of different samples

醬油發(fā)酵基料中染料木素的含量為0.43%，經(jīng)過(guò)提取后所得染料木素粗提物含量為12.75%，得率為87.91%。將粗提物用硅膠進(jìn)行柱層析分離得到染料木素單體，含量為96.78%，得率為18.94%。將所得染料木素單體用于后續(xù)線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。

2.2 染料木素體外抗氧化活性的測(cè)定

圖2 染料木素對(duì)自由基的影響Fig.2 Effects of genistein on free radicals

自由基在機(jī)體代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生，當(dāng)體內(nèi)自由基過(guò)多，抗氧化物質(zhì)不足以抑制時(shí)，誘發(fā)多種疾病，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老[22]。

圖2a表明，染料木素清除DPPH自由基能力呈濃度依賴性，IC50為0.35 mg/mL，在0.125～0.5 mg/mL范圍，隨著樣品質(zhì)量濃度增大，對(duì)DPPH自由基清除能力快速上升，在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，DPPH清除率達(dá)到69.71%。從圖2b可知，染料木素清除ABTS自由基能力在0.125～0.5 mg/mL范圍，隨濃度增加呈較陡趨勢(shì)，隨后趨于穩(wěn)定，在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，DPPH清除率達(dá)到86.89%，IC50為0.16 mg/mL。圖2c表明，隨著染料木素濃度增加，清除超氧陰離子自由基能力越來(lái)越強(qiáng)，IC50為0.29 mg/mL，在0.5 mg/mL質(zhì)量濃度后清除率保持穩(wěn)定，2 mg/mL最大清除率為68.33%。由圖2d可得，在0.125～1.0 mg/mL范圍，染料木素清除羥基自由基能力增加迅猛，隨后趨于平穩(wěn)，在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率可達(dá)到76.62%，IC50為0.72 mg/mL。

自由基的清除能力是體外抗氧化能力評(píng)價(jià)中廣泛采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)，總結(jié)來(lái)看，染料木素在DPPH自由基、ABTS自由基、超氧陰離子及羥基自由基的清除試驗(yàn)中，雖清除效果低于同等樣品濃度下的抗壞血酸，但依然表現(xiàn)出有效的抗氧化能力，由此可知，染料木素是一種具研究潛力的抗氧化劑。染料木素會(huì)比自由基優(yōu)先進(jìn)入生物膜，并通過(guò)降低自由基的流動(dòng)性來(lái)抑制生物膜的氧化，同時(shí)抑制自由基進(jìn)入生物膜[23]。大量研究也表明，植物多酚具有良好的抗氧化能力，如茶多酚等[24]，郭虹雯等[25]發(fā)現(xiàn)武夷巖茶多酚ABTS清除活性分別為140.27 mg GAE/g；DPPH清除活性分別為182.66 mg GAE/g。李偉等[26]研究指出桉葉多酚具有清除超氧陰離子自由基能力，當(dāng)濃度為2.56 mg/mL時(shí)超氧陰離子自由基能力清除率為41.16%，表明染料木素清除超氧陰離子自由基能力更優(yōu)于桉葉多酚。

2.3 染料木素對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

研究指出，機(jī)體缺乏雌激素，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)自由基清除減少、氧化應(yīng)激升高。染料木素作為雌激素替代療法，可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體損傷的方式達(dá)到延緩衰老的目的[27]。與對(duì)照組相比，用濃度為50、100和200 μmol/L的染料木素處理野生型線蟲(chóng)，會(huì)使線蟲(chóng)存活曲線顯著向右移動(dòng)（圖3），分別將平均壽命分別延長(zhǎng)了17.54%、20.88%及17.72%，同時(shí)顯著增加了秀麗隱桿線蟲(chóng)的中位壽命和最大壽命（表2）。其中100 μM濃度染料木素效果最好，能延長(zhǎng)12.14%中位壽命和34.55%最大壽命，抗衰老最強(qiáng)。大量研究表明，許多具有抗氧化活性的植物多酚也具有抗衰老作用，例如槲皮素、白藜蘆醇等[28]。亞麻木酚素是一種植物雌激素，Lu等[30]發(fā)現(xiàn)，500 μmol/L亞麻木酚素能顯著提高線蟲(chóng)22.00%平均壽命。而100 μmol/L染料木素抗衰老能力與500 μmol/L亞麻木酚素相近。研究指出，DAF-16/ FOXO通路促進(jìn)長(zhǎng)壽，熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（HSF-1）增加了老daf-2突變體線蟲(chóng)的免疫能力，p38促分裂原激活的蛋白激酶1（PMK-1），是免疫力的關(guān)鍵決定因素[30]。

圖3 染料木素對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響Fig.3 Effects of genistein on the lifespan inC. elegans

表2 線蟲(chóng)存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 2 Statistical analysis of survival time inC. elegans

表3 熱應(yīng)激下線蟲(chóng)存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 3 Statistical analysis of survival time inC.elegansunder high temperature stress

2.4 熱應(yīng)激下染料木素對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

在現(xiàn)代集約機(jī)械化養(yǎng)殖模式下，牲畜更易處于應(yīng)激狀態(tài)，自由基容易堆積在動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)機(jī)體造成損傷，不僅降低動(dòng)物的抗壓能力，同時(shí)對(duì)生產(chǎn)性能也造成破壞[31]。增強(qiáng)耐環(huán)境應(yīng)力，是提高環(huán)境壓力下存活率的關(guān)鍵因素[32]。在熱應(yīng)激條件下，50、100和200 μM的染料木素處理野生型線蟲(chóng)，會(huì)使線蟲(chóng)存活曲線向右移動(dòng)（圖4），并顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)15.32%、23.88%及16.65%平均壽命，同時(shí)顯著提高線蟲(chóng)的中位壽命和最大壽命（表3）。其中100 μmol/L濃度染料木素效果最好，能延長(zhǎng)21.74%中位壽命和26.32%最大壽命，抗熱應(yīng)激能力最強(qiáng)。研究指出，苦瓜皂苷可以提高熱應(yīng)激條件下線蟲(chóng)11.00%的平均壽命，并提高了野生型線蟲(chóng)11.00%的平均壽命，在提高抗逆性的同時(shí)改善了線蟲(chóng)的健康壽命[33]。而染料木素的抗熱應(yīng)激能力更強(qiáng)于苦瓜皂苷。研究指出，與野生型N2動(dòng)物相比，grk-1突變體可從急性熱應(yīng)激中恢復(fù)更多。G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRKs）調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲(chóng)的熱應(yīng)激反應(yīng)[34]。

圖4 熱應(yīng)激下染料木素對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響Fig.4 Effects of genistein on the lifespan inC.elegans under high temperature stress

2.5 染料木素對(duì)線蟲(chóng)壽命生理功能的影響

運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，運(yùn)動(dòng)疲勞會(huì)引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致抗氧化能力降低[35]。機(jī)體的衰老伴隨著運(yùn)動(dòng)能力的下降和表明肌肉的物理退化。如圖5，分析了線蟲(chóng)生命的早、中和晚期（分別在第5、10及15 d）的運(yùn)動(dòng)情況，經(jīng)過(guò)不同濃度染料木素處理后，不同時(shí)期線蟲(chóng)的自發(fā)運(yùn)動(dòng)比例高于對(duì)照組，尤其是在中晚期。此外，通過(guò)對(duì)線蟲(chóng)身體彎曲頻率（正弦運(yùn)動(dòng)）和頭擺頻率來(lái)評(píng)價(jià)線蟲(chóng)不同部位的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，與對(duì)照組相比，50、100和200 μmol/L染料木素的介入在不同程度上提高了運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，其中在15 d時(shí)最為顯著，分別提高了線蟲(chóng)25.17%、75.87%和64.34%的頭擺頻率，并同時(shí)提高31.29%、48.25%和33.57%的正弦運(yùn)動(dòng)頻率。這些結(jié)果說(shuō)明染料木素可以減緩衰老帶來(lái)的運(yùn)動(dòng)能力的退化。

圖5 染料木素對(duì)線蟲(chóng)生理功能的影響Fig.5 Effects of genistein on the physiological function inC. elegans

為研究染料木素對(duì)線蟲(chóng)生殖的影響，測(cè)量了線蟲(chóng)產(chǎn)卵周期每一天的產(chǎn)卵量，圖5d表明，50、100和200 μmol/L的染料木素處理分別提高17.96%、27.84%和41.37%的產(chǎn)卵總量，說(shuō)明染料木素能顯著提高線蟲(chóng)的產(chǎn)卵總量，且這種提高呈濃度依賴性。研究表明，染料木素可與垂體、下丘腦等處的雌二醇受體結(jié)合[36]，通過(guò)影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)來(lái)提升睪酮、生長(zhǎng)激素和催乳素在血清中的濃度，達(dá)到促進(jìn)生殖系統(tǒng)的發(fā)育和提高繁殖能力[37]的效果。研究指出，在飼料中添加15～60 mg/kg的大豆異黃酮，可顯著促進(jìn)蛋雞雌二醇和卵黃蛋白原的分泌，提高產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)[36]。大豆異黃酮具有的雌激素作用，使線蟲(chóng)的產(chǎn)卵能力顯著提高[38]。

2.6 染料木素對(duì)線蟲(chóng)抗氧化防御體系的影響

研究指出，體內(nèi)的抗氧化劑可以提升防御系統(tǒng)的能力，緩解過(guò)量ROS引起的氧化應(yīng)激，酶和非酶抗氧化防御系統(tǒng)在機(jī)體保護(hù)中起著關(guān)鍵的作用[39]。MDA是一種氧化應(yīng)激產(chǎn)物，是反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度的重要指標(biāo)。50、100和200 μmol/L染料木素分別顯著降低了線蟲(chóng)體內(nèi)的46.50%、73.52%和62.72% MDA含量，說(shuō)明染料木素能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而降低線蟲(chóng)的氧化應(yīng)激。SOD在清除動(dòng)物體過(guò)多超氧陰離子自由基中起到關(guān)鍵作用[40]，自由基可被體內(nèi)的SOD轉(zhuǎn)化為毒性較小的H2O2，再通過(guò)催化生成H2O，從而減少氧化帶來(lái)的損傷。50、100和200 μmol/L染料木素分別顯著提高線蟲(chóng)體內(nèi)37.32%、31.51%和44.05% SOD含量。GSH作為重要的還原劑，參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)，其通過(guò)巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，可直接使自由基還原成酸性物質(zhì)，從而加速自由基的排泄，并對(duì)抗自由基對(duì)機(jī)體的損害[41]，較空白組線蟲(chóng)而言，進(jìn)食50、100和200 μmol/L染料木素的線蟲(chóng)組分別提高10.39%、36.21%和25.84%的GSH含量，同時(shí)提高了線蟲(chóng)體內(nèi)144.52%、253.87%和295.60%的CAT酶活力。結(jié)果表明染料木素可能具有激活線蟲(chóng)酶促和非酶促抗氧化防御系統(tǒng)的潛力，對(duì)提高線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化能力、緩解線蟲(chóng)衰老均有積極作用。Chen等[42]發(fā)現(xiàn)佛手黃酮可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)14.94%平均壽命，降低體內(nèi)56.06% MDA含量，同時(shí)提高103.15%和81.91% SOD和CAT酶活性，展現(xiàn)了植物多酚良好的抗衰老活性。

圖6 染料木素對(duì)線蟲(chóng)壽命抗氧化防御系統(tǒng)的影響Fig.6 Effects of genistein on the antioxidant defense system inC. elegans

2.7 染料木素對(duì)線蟲(chóng)活性氧自由基積累量的影響

過(guò)量的活性氧（ROS）引起的氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物分子功能受損的原因[43]，過(guò)量的自由基通過(guò)使細(xì)胞老化等方式累加速機(jī)體衰老，從而破壞蛋白和DNA，最終引起癌癥等慢性疾病[44]。染料木素結(jié)構(gòu)中的含有多個(gè)酚羥基，不僅可以成為自由基的供氫體，還可以螯合有害金屬離子，來(lái)增強(qiáng)其與自由基結(jié)合的能力，從而清除機(jī)體內(nèi)的自由基。經(jīng)過(guò)染料木素96 h處理，50、100和200 μmol/L濃度的染料木素均顯著降低線蟲(chóng)體內(nèi)31.22%、38.57%和41.40%活性氧的積累量，這表明染料木素在線蟲(chóng)體內(nèi)表現(xiàn)較強(qiáng)的抗氧化能力。有研究指出，植物多酚如二氫楊梅素等能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)ROS的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗氧化損傷的作用[45]。姜黃素是姜科植物中的酸性多酚，Lin等[43]指出姜黃素可以清除體內(nèi)的ROS，降低過(guò)氧化脂質(zhì)水平，減輕紫外線造成的DNA損傷，從而達(dá)到抗氧化作用。Lin等[43]在用鼠尾草酚喂養(yǎng)線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，濃度為180 μmol/L時(shí)，鼠尾草酚可以降低線蟲(chóng)體內(nèi)76% ROS積累量。

圖7 染料木素對(duì)線蟲(chóng)活性氧積累量的影響Fig.7 Effects of genistein treatment on ROS accumulation in C.elegans

3 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明醬油發(fā)酵基料中染料木素在體外能有效清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基及超氧陰離子自由基，具有良好體外抗氧化能力。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲(chóng)模型評(píng)價(jià)染料木素的體內(nèi)抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)50、100和200 μmol/L濃度染料木素能顯著提高正常和熱應(yīng)激下線蟲(chóng)壽命，改善線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力，且提高產(chǎn)卵能力。此外，染料木素能顯著降低線蟲(chóng)體內(nèi)ROS積累和MDA水平，提高CAT活性、SOD活性及GSH含量，改善線蟲(chóng)抗氧化防御能力，具有良好體內(nèi)抗氧化作用，其中100 μmol/L染料木素抗氧化效果最好。本研究初步探究了染料木素的體外抗氧化和對(duì)秀麗隱苷桿線蟲(chóng)的體內(nèi)抗氧化活性，但起抗氧化作用的保護(hù)機(jī)制通路還有待深入開(kāi)展研究?？傮w來(lái)說(shuō)，染料木素具有抗氧化延長(zhǎng)健康壽命的作用，為染料木素在醫(yī)藥、飼料、保健品的添加量提供理論指導(dǎo)。