姚敦跳，趙悅，劉仁杰*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

（2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 011500）

有機磷農(nóng)藥（OPPs）是一種經(jīng)濟、高效的殺蟲劑，應用廣泛，不僅給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了有力的保障，同時也給人類的生存環(huán)境造成污染[1]。對非目標物質(zhì)也具有一定的毒性，且作用持久。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，農(nóng)藥的使用量越來越多，在日常生活中，農(nóng)藥污染已經(jīng)進入土壤、大氣、水體，甚至食物鏈，導致農(nóng)殘在人體蓄積產(chǎn)生慢性中毒，如：頭痛、頭暈、乏力、食欲不振、惡心、氣短、胸悶等癥狀。殘留的有機磷農(nóng)藥通過食物鏈進入人體，磷原子同體內(nèi)膽堿酯酶（ChE）共價結合形成磷?；付Щ?，阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解，導致乙酰膽堿堆積，造成突觸過渡興奮，抑制神經(jīng)沖動傳導，引發(fā)一系列綜合癥，如神經(jīng)、生殖及免疫的毒性[2]。在慢性的染毒情況下，多種有機磷均可引起動物ChE活性受到抑制，從而出現(xiàn)中毒的狀況，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎和血液里均有中毒性的癥狀，造成不同的損傷[3]。有機磷農(nóng)藥對人類的生產(chǎn)和生活起著重要的作用，但隨之也帶來了一系列問題。有機磷農(nóng)殘對人體的健康和引起的安全問題值得人們?nèi)リP注。

自然界中存在著極其豐富的微生物資源，在降解農(nóng)藥中起到重要作用。通過發(fā)酵來降解殘留的有機磷農(nóng)藥，已經(jīng)取得了較好的效果[4]。Islam等[5]研究表明，泡菜中分離出來的短乳桿菌可有效降解毒死蜱。Bo等[6]研究表明，酸奶加工過程中，有機磷農(nóng)藥含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸降低。綜上，本研究將利用乳酸菌對慢性有機磷農(nóng)藥中毒小鼠進行干預，并檢測一系列指標，分析小鼠肝和腦的細胞受損情況，初步探索乳酸菌對慢性有機磷中毒小鼠的解毒功效，以期為人體農(nóng)殘慢性中毒的解毒提供理論支持和借鑒方法。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)與道德聲明

健康成年雄性昆明小鼠50只，體重25～30 g，由長春市實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(遼)2020-0001。小鼠按常規(guī)飼養(yǎng)并適應環(huán)境一周，溫度為20～25 ℃，濕度為25%～35%。

1.2 試劑

氧化樂果標準品，購自北京勤誠亦信科技發(fā)展有限公司；丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、膽堿酯酶（ChE）、活性氧（ROS）和蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒，購自南京建城生物工程研究所。

1.3 植物乳桿菌Z3菌懸液的制備

從東北自然發(fā)酵酸菜中分離、篩選植物乳桿菌，經(jīng)馴化后命名為植物乳桿菌Z3。脫脂乳粉培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，生理鹽水洗滌3次，制備菌懸液（～1×1010cfu/mL）。

1.4 慢性有機磷中毒模型的建立

經(jīng)過預實驗摸索有機磷慢性小鼠中毒的模型，隨機選擇8只小鼠作為空白對照組，另42只小鼠每天皮下注射氧化樂果溶液（3 mg/kg），連續(xù)4周，構建慢性有機磷中毒模型，空白對照組同時給予等量生理鹽水。試劑盒的方法測定小鼠腦和全血組織的膽堿酯酶（ChE）活性、腦組織活性氧（ROS）含量、肝臟和血清的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，以確定小鼠有機磷慢性中毒建模成功。

1.5 灌胃方法

建模成功后，選取32只小鼠分為模型組8只、植物乳桿菌Z3低劑量組（～1×108cfu/mL）、中劑量組（～1×109cfu/mL）和高劑量組（～1×1010cfu/mL）各8只。每天上午9:00，低、中、高劑量組小鼠灌胃植物乳桿菌Z3，劑量為10 mL/kg。模型組與空白對照組灌胃等量生理鹽水持續(xù)灌胃4周。

1.6 生化指標的測定

灌胃結束后，禁食12 h，眼眶取血，處死，取小鼠肝臟和腦，沖洗表面殘留血液。取0.1 mL血，加0.4 mL雙蒸水，測ChE活性。另取血3000 r/min離心20 min，測血清MDA和T-SOD值。取腦和肝各0.3 g，加生理鹽水制成勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液，測ChE、T-SOD活性、ROS和MDA含量，采用試劑盒方法，按說明操作。

1.7 組織病理學觀察

取部分肝、腦組織4%多聚甲醛溶液室溫固定24 h，石蠟包埋，切5 μm切片蘇木精-伊紅染色，400倍光學顯微鏡下觀察各切片的病理變化。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差（SEM）表示，使用單向ANOVA，然后進行LSDt檢驗來比較組間的差異，p＜0.05表示顯著。使用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。使用GraphPad Prism制作統(tǒng)計圖。

2 結果與討論

2.1 Z3對小鼠ChE活性的影響

通過植物乳桿菌Z3對模型組和對照組的干預，檢測對小鼠血和腦組織ChE活性的影響，結果如圖1所示。

圖1 植物乳桿菌Z3對慢性有機磷中毒小鼠全血和腦組織ChE活性的影響Fig.1 Effect ofLactobacillus plantarum Z3 on ChE activity in blood and brain tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

檢測血和腦ChE結果表明：全血的空白組ChE活性為99.86 U/mL，模型組ChE活性為62.20 U/mL，模型組ChE（62.20 U/mL）活性顯著低于空白對照組。與模型組相比，植物乳桿菌中、高劑量組ChE活性顯著升高（圖1a），中劑量組ChE活性提高了31.30%，高劑量組ChE活性提高了36.13%?？瞻讓φ战MChE（99.86 U/mL）活性顯著高于模型組，表明造模成功。高劑量組ChE（0.96 U/mg）活性顯著高于模型組ChE（0.53 U/mg），高劑量組ChE較模型組提高了81.13%，表明高劑量植物乳桿菌組能有效改善腦組織ChE活性，但未使中毒小鼠ChE（0.53 U/mg）水平完全恢復（圖1b）?？梢?，植物乳桿菌能提高有機磷慢性中毒小鼠血和腦的ChE活性，在一定范圍內(nèi)，劑量越大，效果越明顯。其作用的機制可能由乳酸菌內(nèi)含有的有機磷降解酶系協(xié)同作用，分解小鼠體內(nèi)的有機磷農(nóng)殘，從而使老化的ChE被重新激活[7]。

2.2 Z3對脂質(zhì)過氧化損傷的影響

通過對模型小鼠灌胃植物乳桿菌Z3，對小鼠的脂質(zhì)過氧化損傷影響，結果如圖2所示。

圖2 植物乳桿菌Z3對慢性有機磷中毒小鼠血清和肝組織MDA含量的影響Fig.2 Effect ofLactobacillus plantarum Z3on MDA content in serum and liver tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

試驗結果表明：對照組小鼠血清MDA（1.68 nmol/mL）含量顯著低于模型組MDA（2.94 nmol/mL），高劑量組MDA（2.09 nmol/mL）含量顯著低于模型組，對照組血清MAD比模型組低42.85%，高劑量組MDA比模型組低28.91%，表明高劑量Z3干預可降低小鼠血清MDA含量，效果顯著（圖2a）。模型小鼠肝組織中MDA含量與空白對照組相比差異明顯。在肝組織中，氧化樂果使慢性中毒小鼠體內(nèi)MDA含量增加，氧化損傷嚴重。與模型組相比，高劑量組MDA（0.66nmol/mL）含量明顯低于模型組，說明Z3的中、高劑量組均能顯著降低氧樂果致慢性中毒小鼠的MDA（0.79 nmol/mL）含量，中劑量組MDA比模型組低13.92%，高劑量組MDA比模型組低16.46%，但高劑量組作用更顯著（圖2a）。由此，Z3可有效改善氧樂果致慢性中毒小鼠體內(nèi)的氧化應激反應，降低自由基對小鼠組織器官的氧化損傷，與周先容等的報道相一致[8]。但其如何降低氧化應激損傷的作用機理有待于進一步研究。

2.3 Z3對血清及肝組織T-SOD值的影響

通過植物乳桿菌Z3對模型組和對照組的干預，對血清中T-SOD值的影響，結果如圖3所示。

圖3 植物乳桿菌Z3對慢性有機磷中毒小鼠血清和肝組織T-SOD值的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarumZ3on T-SOD activity in serum and liver tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

結果表明：模型組的T-SOD（48.39 U/mL）活性明顯低于空白對照組T-SOD（87.82 U/mL），高劑量組T-SOD（75.94 U/mL）活性顯著高于模型組，高劑量組T-SOD活性比模型組高56.93%，說明植物乳桿菌Z3高劑量組對提高血清中T-SOD水平有良好的效果（圖3a）。模型組的T-SOD（83.08 U/mg）活性與空白組T-SOD（145.27 U/mg）相比有明顯差異，慢性有機磷中毒小鼠肝損傷較為嚴重。中、高劑量組T-SOD活性明顯高于模型組，中劑量組T-SOD活性比模型組高56.04%，高劑量組T-SOD活性比模型組高65.14%?？梢?，中、高劑量組對慢性有機磷中毒小鼠肝組織T-SOD活性有明顯的改善作用（圖3b）。SOD可清除氧自由基，保護細胞免受損傷，對體內(nèi)抗氧化能力和氧化穩(wěn)態(tài)有重要影響。乳酸菌具有抗脂質(zhì)過氧化、清除羥自由基和超氧陰離子的作用。這種特性可能是影響中毒小鼠灌胃前后SOD變化的關鍵因素。灌胃植物乳桿菌可顯著提高T-SOD的活性，其可能的機制是通過上調(diào)抗氧化基因、氧化還原酶類基因和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因的轉(zhuǎn)錄表達，進而通過生物調(diào)節(jié)、粘附功能、代謝過程等降低機體的炎癥水平，從而減少氧化損傷引起的細胞凋亡[9]。

2.4 Z3對腦組織ROS含量的影響

通過植物乳桿菌Z3對模型組和對照組的干預，對腦組織ROS含量的影響，結果如圖4所示。

圖4 植物乳桿菌Z3對慢性有機磷中毒小鼠腦組織ROS含量的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus plantarum Z3 on ROS content in brain tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

試驗結果表明：在腦組織中，模型組ROS（58.67 U/mL）的含量明顯高于對照組ROS（18.00 U/mL）；Z3各劑量組的ROS含量均下降，而高劑量組ROS（49.33 U/mL）與模型組ROS（58.67 U/mL）差異明顯，模型組ROS比高劑量組高15.92%。低劑量組與高劑量組也有明顯的差異。由此可見，Z3中、高劑量組降低ROS含量效果明顯（圖4）。長期低劑量攝入有機磷農(nóng)藥會加速器官衰竭，縮短機體壽命，通過抑制線粒體ATP合成，導致腦組織核DNA單鏈斷裂，增加ROS含量，破壞細胞的穩(wěn)態(tài)，導致細胞程序性死亡。氧化應激中ROS的過量積累會引起脂質(zhì)過氧化，增加細胞膜透性，導致關鍵酶失活，對機體損傷嚴重。據(jù)報道乳酸菌可以有效減少ROS的積累，通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的產(chǎn)生，顯著降低細胞的氧化應激[10,11]。與本研究結果相一致。

2.5 Z3對小鼠肝腦組織細胞的影響

圖5 肝臟和腦組織學切片F(xiàn)ig.5 Representative histological images of liver and brain slices (stained with hematoxylin and eosin)

通過灌胃植物乳桿菌Z3，對小鼠肝臟和腦組織切片鏡檢，400倍光學顯微鏡下觀察各切片的病理變化，結果如圖5所示。

由圖5可見，健康小鼠肝臟切片細胞結構良好，中心靜脈完整，肝小葉結構清晰，肝細胞結構正常，染色均勻；模型組肝臟部分壞死，肝小葉結構不同程度受損，肝中央靜脈擴張，部分肝細胞脂肪變性，肝竇內(nèi)有大量壞死細胞碎片，細胞核較厚，Z3劑量組肝細胞損傷程度明顯小于模型組，肝細胞輕度增大，少量肝小葉結構受損（圖5a～c）。腦組織切片鏡檢顯示，空白對照組神經(jīng)細胞排列整齊，細胞核形態(tài)正常，組織結構完整，組織致密，核仁清晰，細胞周圍無水腫；模型組腦神經(jīng)細胞核增大，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞固縮，細胞排列紊亂；Z3組腦神經(jīng)細胞排列整齊，細胞形態(tài)正常（圖5d～f）。有機磷農(nóng)藥進入人體后主要在肝臟轉(zhuǎn)化，在肝臟中分布濃度最高，在代謝過程中產(chǎn)生大量氧自由基，對肝臟細胞造成損害的同時，隨著血液循環(huán)損傷腦組織[12]。機體通過酶系統(tǒng)和非酶促的抗氧化系統(tǒng)來應對氧化應激損傷。本研究中通過植物乳桿菌Z3的攝入，有助于保護和修復機體臟器的損傷，與李常坤等的研究結果相符[13]。

2.6 討論

在有機磷慢性中毒小鼠的大腦中，乙酰膽堿能受體數(shù)量減少，膽堿能遞質(zhì)親和力降低，機體對ChE有耐受性，使膽堿能神經(jīng)持續(xù)興奮，影響中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)ChE的抑制作用[14]。乙酰膽堿（ACh）在膽堿能突觸上積聚，膽堿能受體被過度刺激，出現(xiàn)震顫、肌肉抽搐等有機磷中毒癥狀[15]。腦組織中的ChE失活，導致神經(jīng)遞質(zhì)ACh積聚，出現(xiàn)代謝紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)反應遲鈍等一系列癥狀。有機磷農(nóng)藥通過食物鏈進入人體，不斷的蓄積后對機體造成慢性損傷：破壞免疫系統(tǒng)；抑制人體ChE的活性；慢性有機磷中毒的臨床表現(xiàn)為隱匿性和非特異性，使人們在日常生活中缺乏必要的重視和防護。植物乳桿菌能激活衰老和失活的ChE，起到一定得解毒效應，減少神經(jīng)遞質(zhì)ACh的積累，一程度上恢復ChE的活性，修復機體損傷。MDA含量間接反映了自由基對機體損傷的程度，MDA會引起大分子物質(zhì)的交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細胞毒性。MDA含量越高，生物膜破壞越嚴重[6]。本研究中植物乳桿菌Z3高劑量組MDA含量與模型組有顯著差異，說明植物乳桿菌可改善肝組織氧化應激損傷，減輕有機磷中毒對機體的影響。綜上可見，植物乳桿菌Z3對有機磷慢性中毒小鼠有一定的解毒作用：能顯著改善氧樂果中毒所致的肝和腦組織損傷，恢復部分ChE活性。這一結果與微生物體外降解有機磷農(nóng)藥的報道相一致。

3 結論

目前，人們的生活已經(jīng)離不開被有機磷農(nóng)殘污染的食品、蔬菜、水果，甚至水源，這些農(nóng)藥殘留通過食物鏈進入人體，并隨著農(nóng)藥的使用而蓄積，從而導致農(nóng)殘慢性中毒。本論文通過灌胃植物乳桿菌Z3，發(fā)現(xiàn)對慢性有機磷中毒小鼠具有一定的解毒作用，研究結果對人體內(nèi)農(nóng)藥殘留的分解、排出具有借鑒意義，為修復農(nóng)殘導致的機體損傷提供理論支持。