何宇星，其其日力格，劉瑋，段曉霞，邱崇順，烏云達(dá)來*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）（2.蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 011599）（3.聯(lián)邦制藥有限公司，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000）

“益生菌”是一類通過合理、足量的攝入后，對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活性微生物[1,2]。其能改善機(jī)體腸道微生物菌群的平衡[3]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]、發(fā)揮抗氧化作用[5]、降低膽固醇水平[6]、緩解乳糖不耐癥[7]等益生作用。而發(fā)揮益生作用的主要場(chǎng)所是腸道，例如與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而抑制其生長(zhǎng)[8]，通過調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡，防止或減少機(jī)會(huì)致病菌的黏附，降低炎癥反應(yīng)、釋放免疫因子等提高機(jī)體免疫力等[9,10]。但是只有耐酸、耐膽鹽、通過胃腸道后能存活的益生菌，才能發(fā)揮在機(jī)體中的益生作用，因?yàn)閺?qiáng)酸性的胃液環(huán)境，會(huì)殺死或抑制其活性[11]。為保證菌株的活性，須具有很強(qiáng)的耐酸能力，進(jìn)而順利抵達(dá)人體腸道，黏附并定殖在腸道內(nèi)且發(fā)揮益生作用[12]。

酸馬奶是益生菌來源的寶庫，開發(fā)利用這種特定生態(tài)環(huán)境中的益生菌，具有重要的意義。因?yàn)槠涓缓幸嫖⑸?、維生素和多種功能活性物質(zhì)，蒙古族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在此基礎(chǔ)上創(chuàng)立了“酸馬奶療法”[13]，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及比例適宜人體消化吸收，因其具有輔助治療冠狀動(dòng)脈硬化、貧血，提高免疫力，降血壓、血脂等功效，享有很高的知名度和市場(chǎng)占有率[14]。而且酸馬奶在世界各地已有很久的食用歷史，經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇作用，優(yōu)質(zhì)的乳酸菌菌種逐漸流傳下來，是獲得優(yōu)質(zhì)乳酸菌的良好來源[15,16]。因此，分離酸馬奶中的益生菌，具有重要的意義和前景。

本文對(duì)蒙古國(guó)牧區(qū)酸馬奶樣品中分離的乳酸菌通過耐酸、耐膽鹽、耐模擬人工胃腸液、抗生素藥敏試驗(yàn)以及細(xì)胞表面疏水性等試驗(yàn)進(jìn)行潛在益生菌的篩選研究，最終選定一株優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行菌種鑒定，該研究結(jié)果為開發(fā)優(yōu)良的潛在益生菌菌株提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與主要試劑

197株供試乳酸菌菌株均分離于蒙古國(guó)酸馬奶樣品[17]；HBI乳酸菌生化鑒定條，青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；抗菌藥物藥敏紙片，常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)菌株的準(zhǔn)備

1.2.1 活化菌株

將-80 ℃甘油保藏的菌株按2%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，連續(xù)活化3代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 供試菌液的制備

第三代活化的菌株離心后（5000r/min，8 min)，用滅菌PBS緩沖溶液清洗3次，調(diào)至菌懸液濃度為1.0×109CFU/mL，備用。

1.3 活菌數(shù)的測(cè)定

參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[18]的方法，取1.0 mL供試菌液與9.0 mL的0.9%的生理鹽水混勻，依次梯度稀釋至10-7、10-8、10-9，取稀釋液1.0 mL，用46±1 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基，傾注法測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)，每個(gè)稀釋梯度做2個(gè)平皿。

1.4 潛在益生作用乳酸菌的篩選

1.4.1 耐酸性試驗(yàn)[19]

將197株乳酸菌按照1.2.2中方法制備供試菌液，分別接種于pH值為2.0、2.5、3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)量OD595nm值，挑選耐酸性較好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 耐膽鹽能力試驗(yàn)[20]

在1.4.1中篩選耐pH 2.0的乳酸菌，按照1.2.2的方法制備供試菌液，將菌液按2%（V/V）的接種量接入到膽鹽添加濃度為0.3%（m/V）的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16～18 h，測(cè)定其在OD630nm值，同時(shí)劃線培養(yǎng)于膽鹽濃度為0.3%（m/V）的MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，并觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.4.3 耐模擬人工胃液試驗(yàn)

將耐酸性和耐膽鹽能力良好的菌株連續(xù)培養(yǎng)三代，按照文獻(xiàn)[21]的方法微調(diào)整，將菌液離心（3000 r/min、10 min）后收集菌泥，用滅菌生理鹽水離心洗滌2次，將5.0 mL生理鹽水加入到菌泥中，混勻制成菌懸液，各取1.0 mL菌懸液分別接種于9.0 mL經(jīng)0.22 μm濾菌膜處理后pH 2.0的模擬人工胃液試管中，充分混勻后37 ℃下厭氧培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)開始0 h和3 h后分別取樣，測(cè)定其活菌數(shù)（CFU/mL）。選擇大于80%的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.4 耐模擬人工腸液試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[22]中的方法微調(diào)整，將模擬人工胃液試驗(yàn)中處理3 h后的菌液，接種于經(jīng)過濾除菌的模擬人工腸液（pH 8.0）中，37 ℃下培養(yǎng)，并分別于0 h、4 h、8 h時(shí)測(cè)定其活菌數(shù)（CFU/mL）。

人工腸液：將下述a液和b液以2:1比例混合。

a、胰腺液：NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、胰蛋白酶0.1%，調(diào)整pH值為8.0后，過濾除菌備用。

b、膽液：牛膽鹽1.2%，調(diào)整pH值為8.0后，過濾除菌備用。

1.5 潛在益生菌的益生特性研究

1.5.1 細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定[23]

將1.4.4中篩選的潛在益生作用菌株活化2代后，接種于無菌MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16～18 h，離心（9500 r/min，4 ℃，10 min）收集菌體，用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次，將沉淀用緩沖液懸浮。以緩沖液為空白對(duì)照，調(diào)整菌體濃度，使其初始濃度在600 nm波長(zhǎng)處吸光度約為1.0。取4.0 mL調(diào)整濁度后的菌液，加入0.8 mL二甲苯，高速渦旋2 min，靜置10 min分層，取下層水相在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。按如下公式計(jì)算乳酸菌細(xì)胞表面疏水性：

式中：

A0、A——與二甲苯混勻前、后菌液在600 nm處的吸光度。

1.5.2 抗生素藥敏試驗(yàn)

表1 抗生素的種類、藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Types of antibiotics, drug content of drug sensitive discs and criteria for determining the diameter of inhibition zone

采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法[24]，取200 μL潛在益生菌菌液在MRS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，待平板表面稍干，將抗生素紙片均勻間隔放置于表面上，共10種抗生素（氨芐西林、頭孢拉定、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、鏈霉素、氯霉素、諾氟沙星、克林霉素），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑（mm）。

1.6 潛在益生菌的菌種鑒定

1.6.1 菌落形態(tài)觀察

將活化三代的潛在益生菌劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌株和菌落形態(tài)[25]。

1.6.2 糖類發(fā)酵試驗(yàn)

根據(jù)HBI乳酸菌生化鑒定條的使用說明書，將潛在益生菌進(jìn)行生理生化鑒定。37 ℃培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)結(jié)束后觀察并做記錄。

1.6.3 分子生物學(xué)鑒定

將潛在益生菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，8000 r/min離心1 min收集菌泥，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取乳酸菌基因組DNA。提取的基因組DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增[26]：提取的乳酸菌基因組DNA做模板，選擇16S rDNA基因通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃，5 min→95 ℃，30 s→55 ℃，30 s→72 ℃，90 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，并用MEGA 7.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)三次，用SPSS 23.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，用Excel及Origin 8.5進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸性試驗(yàn)

將197株乳酸菌分別接種于pH值為2.0、2.5、3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，篩選出10株存活較好的菌株，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

人體胃液中胃酸的主要成分為鹽酸，其pH值通常為3.0左右，在空腹情況下pH值可達(dá)1.5，只有少數(shù)具有良好耐酸能力的乳酸菌以活菌形式通過胃酸屏障并到達(dá)胃腸道發(fā)揮作用，而食物在胃中停留時(shí)間低于3 h，液體則更短[27]。雖然在pH值為3.0的條件下，菌株在胃液環(huán)境中可保持活性，但是本試驗(yàn)為篩選出性能更加優(yōu)異的菌株，因此選定耐pH值為2.0并保持很高活性的10株優(yōu)勢(shì)乳酸菌，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

表2 10株乳酸菌在不同pH環(huán)境中生長(zhǎng)情況Table 2 Growth of 10 strains of lactic acid bacteria in different pH environments

2.2 耐膽鹽能力試驗(yàn)

將10株耐酸性較好的乳酸菌，接種于膽鹽添加濃度為0.3%（m/V）的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后測(cè)定其在OD630nm值，同時(shí)劃線于膽鹽濃度為0.3%（m/V）的MRS固體培養(yǎng)基上，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 乳酸菌在0.3%膽鹽環(huán)境中生存情況Table 3 Survival of lactic acid bacteria in 0.3% bile salt environment

OD630nm值大于0.5，說明菌株在添加0.3%的膽鹽環(huán)境中長(zhǎng)勢(shì)良好，具有很好的膽鹽耐受性[28]。由表中數(shù)據(jù)可知，10株菌均有不同的耐膽鹽能力，其中菌株49、菌株2-7、菌株2-8、菌株2-20耐受能力較低，菌株2-2、菌株2-13、菌株2-21和菌株2-32耐受能力較好，菌株2-18和2-33耐受能力最好。而正常人體腸道中膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%之間波動(dòng)[29]，這與熊榮園[30]篩選的一株降解鉛的乳酸菌對(duì)膽鹽耐受能力結(jié)果相似。發(fā)揮益生作用的乳酸菌，不僅需要具有良好的耐酸性能、耐膽鹽能力，還需具備通過胃液這樣強(qiáng)酸性的生物屏障，這樣才能順利到達(dá)小腸而發(fā)揮益生作用，因此對(duì)篩選出的10株乳酸菌進(jìn)行模擬人工胃液試驗(yàn)。

2.3 耐模擬人工胃液試驗(yàn)

將2.2中篩選的10株乳酸菌接種于pH值2.0的模擬人工胃液中，于0 h和3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)（CFU/mL），結(jié)果見表4。

表4 乳酸菌耐模擬人工胃液耐受性Table 4 Lactic acid bacteria tolerance simulated artificial gastric juice tolerance

由表4可知，10株菌在胃液中的存活率均不一樣，存活率在80%以上的有3株菌，分別為菌株2-13，菌株2-32，菌株2-33，因此選取這3株菌進(jìn)行下一階段試驗(yàn)，其中菌株2-33存活率最高，可達(dá)95.86%。據(jù)研究報(bào)道，陳明[31]在乳酸菌耐模擬人工胃液試驗(yàn)中，篩選出的11株具有高抗氧化能力的乳酸菌，模擬胃液中存活率均在80%以上。

2.4 耐模擬人工腸液試驗(yàn)

通過耐模擬人工胃液篩選的3株菌在模擬人工腸液試驗(yàn)結(jié)果如表5。

表5 菌株耐模擬人工腸液耐受性Table 5 Resistance of strain to simulated artificial intestinal fluid

由表5可知，將3株菌先在模擬人工胃液里消化3 h再轉(zhuǎn)到pH 8.0的人工腸液，在前4 h內(nèi)3株菌的活菌數(shù)下降不明顯，培養(yǎng)至8 h菌株2-13的活菌數(shù)下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，其余2株菌的活菌數(shù)下降不明顯。通過模擬人工腸液中培養(yǎng)8 h可知，3株菌均保持著較高的存活率，最低為66.51%，最高可達(dá)80.80%，說明3株菌對(duì)模擬人工腸液有一定的適應(yīng)能力，這一結(jié)果與于海靜[32]、鮑雅靜[33]等人的結(jié)果相似。

2.5 細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定

對(duì)通過模擬人工腸液篩選的3株菌，進(jìn)行細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定，結(jié)果如圖1。

圖1 3株乳酸菌細(xì)胞表面疏水率測(cè)定Fig.1 3 strains of lactic acid bacteria cell surface hydrophobicity rate

細(xì)菌在烴-水兩相分離過程中發(fā)生了疏水分配，因而可根據(jù)水相中細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的變化來了解細(xì)胞表面的疏水性[34]。由圖1可知，3株菌的細(xì)胞表面疏水性范圍在2.80%～42.61%之間，其中菌株2-33的疏水率最高，可達(dá)42.61%，其余兩株菌的疏水率均低于20%。不同菌株的疏水性差別較大，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的一致，由此可見菌株2-33對(duì)二甲苯的吸附能力比較強(qiáng)，其次是菌株2-32，再次是菌株2-13。細(xì)胞表面疏水性是決定乳酸菌非特異性粘附的重要?jiǎng)恿35]，疏水性好代表著粘附能力較強(qiáng)，因此，選定菌株2-33為目的菌株。

2.6 抗生素藥敏試驗(yàn)

目的菌株對(duì)抗生素越敏感，在藥敏紙片周圍的活性越弱，形成的透明圈即抑菌圈越大[36]，菌株2-33對(duì)10種抗生素藥敏的結(jié)果如表6。

從表6可知，菌株2-33對(duì)諾氟沙星、頭孢拉定、慶大霉素、萬古霉素以及鏈霉素有耐藥性，不敏感；對(duì)克林霉素中度敏感；對(duì)四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、 氨芐西林敏感。

表6 抗生素敏感試驗(yàn)Table 6 Antibiotic sensitivity test

2.7 菌落形態(tài)觀察

將活化好的菌株2-33劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)（37 ℃，48 h），挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色并觀察菌株形態(tài)，菌種在MRS固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光澤、不透明且顏色為乳白色；經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡觀察結(jié)果為桿狀革蘭氏陽性菌，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株2-33菌落形態(tài)及菌體形態(tài)Fig.2 Bacterial colony morphology and bacterial body morphology of strain 2-33

表7 糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Table 7 Sugar fermentation experiment

2.8 糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[37]

將菌株2-33的單菌落混懸于2 mL生理鹽水中制成菌懸液，將其加入到糖類培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察的結(jié)果如表7。

由表7可知，菌株2-33可利用七葉苷（由紫色變黑色）及其他糖類（均變成黃色），結(jié)果判斷均為陽性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[38]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[39]菌株2-33利用所選糖類的特性與植物乳桿菌的特性相同，因此初步鑒定菌株2-33為植物乳桿菌。

2.9 潛在益生菌株的16S rDNA基因序列分子鑒定

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取方法進(jìn)行了菌株2-33的基因組DNA提取，并進(jìn)行16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增。送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株2-33的16S rDNA因序列Fig.3 16S rDNA gene sequence of strain 2-33

圖4 菌株2-33的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 2-33

將菌株2-33的16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，用MEGA 7繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，2-33與L. plantarum聚類，且與L. plantarumJCM1149具有最高的同源性且達(dá)到100%。菌株2-33的16S rDNA分子鑒定結(jié)果與糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此，鑒定菌株2-33為植物乳桿菌。

3 結(jié)論

益生菌在體內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提條件是能夠順利通過胃酸和膽鹽所構(gòu)成的生物屏障，保證有足夠數(shù)量的活菌穩(wěn)定黏附于腸道上皮細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)定植，進(jìn)而可以充分發(fā)揮益生作用。本文通過耐酸性試驗(yàn)、耐膽鹽能力試驗(yàn)、耐模擬人工胃腸液試驗(yàn)以及細(xì)菌表面疏水性測(cè)定后，選取在模擬人工胃液中存活率達(dá)95.86%、模擬人工腸液中存活率達(dá)80.80%、疏水性為42.61%的菌株2-33為目的菌株。經(jīng)抗生素藥敏試驗(yàn)可知，菌株2-33對(duì)諾氟沙星、頭孢拉定、慶大霉素、萬古霉素以及鏈霉素有耐藥性，不敏感；對(duì)克林霉素中度敏感；對(duì)四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、氨芐西林敏感，該項(xiàng)試驗(yàn)的進(jìn)行，對(duì)評(píng)價(jià)菌株的安全性具有重要意義。最后經(jīng)分子生物學(xué)確定的菌株2-33為植物乳桿菌，與L. plantarumJCM1149同源性達(dá)100%，且菌株2-33的糖類發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與GB 4789.35-2016一致。本研究結(jié)果對(duì)可定植胃腸環(huán)境的功能性乳酸菌資源開發(fā)提供了參考和理論數(shù)據(jù)。