李佳珣，張秋香，王瑞，趙建新

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

表層蛋白是覆蓋在菌體外表面的一層分子量為25～71 ku、單分子排列且可在內(nèi)部自組裝形成對(duì)稱次晶格陣列結(jié)構(gòu)的蛋白或糖蛋白，通常存在于古生菌和一些細(xì)菌當(dāng)中[1]。乳桿菌是一類對(duì)腸道有重要功能的益生菌，主要通過定殖于宿主腸道、與致病菌競爭黏附位點(diǎn)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等機(jī)制實(shí)現(xiàn)其益生功能[2]。而表層蛋白可以作為黏附因子幫助乳桿菌定殖于腸道，但并非所有的乳桿菌都含有表層蛋白[3]。目前報(bào)道的含有表層蛋白的乳桿菌主要集中在嗜酸乳桿菌[4]和卷曲乳桿菌[5]上，更多的攜帶表層蛋白的乳桿菌尚待被發(fā)掘和研究。

通常篩選攜帶表層蛋白的乳桿菌的方法是通過分析實(shí)驗(yàn)菌株LiCl提取物的SDS-PAGE凝膠電泳條帶，判斷在25～71 ku的目標(biāo)分子量范圍內(nèi)是否存在高含量的蛋白條帶，以此確定實(shí)驗(yàn)菌株是否攜帶表層蛋白[6]。而這種方法通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，微生物的全基因組測(cè)序已成為掌握某微生物全部遺傳信息的最佳方式[7]。通過序列比對(duì)尋找攜帶表層蛋白編碼基因的乳桿菌比傳統(tǒng)方法更為高效。

此外，表層蛋白不僅作為黏附因子幫助乳桿菌定殖于腸道，其對(duì)菌株的本身特性有很多影響，如影響菌體在不良環(huán)境中的生長，Yong等[8]利用無菌小鼠模型測(cè)定嗜酸乳桿菌NCFM在腸道中的空間轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)表層蛋白的基因slpA是在腸道中表達(dá)量最高，slp基因缺失突變的菌株對(duì)膽汁攻擊、模擬胃液和高滲透壓的敏感性增加。因此，了解篩選出來的不同種乳桿菌的表層蛋白對(duì)菌株自身特性的影響，也具有重要意義。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室保藏的乳桿菌資源及已測(cè)序的基因組草圖，通過生物信息學(xué)的方法篩選含有編碼表層蛋白slp基因的不同乳桿菌，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定，隨后分析表層蛋白對(duì)菌體自身特性及與致病菌共聚集能力的影響，初步探索不同種乳桿菌的表層蛋白與菌株特性的聯(lián)系，為繼續(xù)研究乳桿菌表層蛋白的其它性質(zhì)和功能提供理論指導(dǎo)和參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜酸乳桿菌NCFM、CCFM720、FFJND7L5、JCM1132，卷曲乳桿菌FHNFQ 15L11、FHBZX 13M4、FCQJJ 9M2、FGuxi 14M5，瑞士乳桿菌D-5-A108、D-6-A122、D-9-A28，鼠李糖乳桿菌FBJCY 2-1、FBJCY 3-1、FAHWH 26-1、FAHWH 30-1均由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.2 主要試劑與儀器

LiCl、冰醋酸、考馬斯亮藍(lán)購自國藥滬試；TEMED購自湖北佰智昂生物化工有限公司；丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰40%溶液（29:1）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PageRulerTM Unstained Protein Ladder購自ThermoFisher Scientific；蛋白酶K（B47041-5MG）購自北京伊諾凱科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（SDS-PAGE Sample Loading buffer）、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

MiniT-C迷你金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；DYY-7C電泳儀，北京市六一儀器廠；GelDoc EZ全自動(dòng)凝膠成像儀，美國伯樂公司（Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌的培養(yǎng)

取出-80 ℃保藏的菌種，以2%的接種量接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h?；罨?代后可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 含S層蛋白的乳桿菌的篩選

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已報(bào)道的乳桿菌slp基因序列，建立本地?cái)?shù)據(jù)庫，選取本中心已有的嗜酸乳桿菌（4株），瑞士乳桿菌（44株），鼠李糖乳桿菌（81株），卷曲乳桿菌（50株）四種菌的基因組草圖進(jìn)行blast比對(duì)，序列匹配度大于90%認(rèn)為有slp基因，可編碼S層蛋白。

1.3.3 表層蛋白的去除和提取

參考Johnson等[9]的方法并做適當(dāng)改動(dòng)。培養(yǎng)好的菌液于室溫下6000 g離心15 min，收集菌體。向菌體中加入原乳桿菌培養(yǎng)液1/20體積的5 mol/L LiCl溶液和蛋白酶K溶液并置于恒溫?fù)u床（37 ℃，220 r/min）處理2 h后，于室溫下12000 ×g離心15 min。收集LiCl溶液提取的上清液以待后續(xù)鑒定，沉淀的菌體即為去除表層蛋白（LiCl溶液處理）和去除所有表面蛋白的乳桿菌（蛋白酶K溶液處理），空白對(duì)照組以PBS代替。

1.3.4 表層蛋白的鑒定

將1.3.3所得的LiCl提取的表層蛋白通過BCA濃度試劑盒測(cè)定濃度，將總蛋白濃度調(diào)整至一致，后與5×loading buffer（4:1，V/V）的比例混合，于95 ℃的干式恒溫金屬浴中反應(yīng)10 min，冷卻后向每個(gè)凝膠孔加入20 μL樣品使總蛋白量在50 μg左右，進(jìn)行電泳。其中，濃縮膠濃度為5%，電泳電壓為80 V；分離膠濃度為12%，電泳電壓120 V。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min，再用脫色液脫色至條帶清晰可見。用全自動(dòng)凝膠成像儀拍攝凝膠[10]。

1.3.5 乳桿菌生長情況的測(cè)定

將1.3.3中LiCl溶液處理，蛋白酶K溶液處理和對(duì)照組的乳桿菌菌體繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)后的菌液混勻并在600 nm波長下測(cè)定的吸光度，根據(jù)吸光值判斷乳桿菌經(jīng)不同處理方式后的生長情況。

1.3.6 乳桿菌自聚集能力的測(cè)定

取1.3.5培養(yǎng)得到的菌液，調(diào)節(jié)菌懸液的濃度為108cfu/mL，將菌懸液渦旋震蕩約10 s，記錄其 OD600nm值為A1，室溫靜置4 h，上清液的OD600nm記為A2，按如下公式計(jì)算自聚集率[11]。

1.3.7 乳桿菌自成膜能力的測(cè)定

在96孔板中加入1.3.5培養(yǎng)得到的菌液200 μL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。陰性對(duì)照組以同等體積的MRS代替。培養(yǎng)結(jié)束后去除培養(yǎng)液，用PBS（磷酸鹽緩沖液）小心清洗生物膜2遍，室溫靜置晾干。向每孔中加入100 μL甲醇以固定生物膜，10 min后除去甲醇，自然晾干，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%的結(jié)晶紫溶液，將生物膜染色30 min。染色結(jié)束后用PBS清洗2遍，每孔以100 μL 33%的冰醋酸溶解，用酶標(biāo)儀 OD600nm讀取吸光度值[12]。

1.3.8 乳桿菌與致病菌共聚集能力的測(cè)定

取得到的三組乳桿菌懸液與白色念珠菌懸液或變異鏈球菌懸液等體積混合并混勻，將混勻后的菌懸液靜置4 h，測(cè)定上清液的OD600nm，記為A4。乳桿菌和病原菌的共聚集率計(jì)算公式如下[14]：

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用Graphpad Prism 8.4.3，R studio 4.0.1，SPSS，使用Two-way anova進(jìn)行方差分析，p＜0.05表示具有顯著性差異，使用R包ggplot2，corrplot和ggsci等進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與討論

2.1 攜帶表層蛋白乳桿菌的篩選與鑒定

隨著測(cè)序技術(shù)的高度發(fā)展，許多乳桿菌的表層蛋白編碼基因相繼被報(bào)道。其中，有些菌株不僅僅含有一個(gè)表層蛋白基因，如短乳桿菌含有4個(gè)slp基因[15]，嗜酸乳桿菌含有2～3個(gè)slp基因[8]。通常slpA基因?yàn)榫幋a表層蛋白的顯性基因，而其他的slp基因如slpB，slpX基因在正常狀況下不表達(dá)[8]。本研究將實(shí)驗(yàn)室保藏的已測(cè)序的基因組草圖的部分乳桿菌與建立的本地slp基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果如圖1所示，其中，4株嗜酸乳桿菌均含有slp基因，50株卷曲乳桿菌中有30株菌含有slp基因，44株瑞士乳桿菌中有3株菌含有slp基因，81株鼠李糖乳桿菌中有30株菌含有slp基因。

圖1 含有slp基因的乳桿菌占比Fig.1 The proportion ofLactobacillus containingslp gene

圖2 乳桿菌LiCl提取物的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE identification ofLactobacillus LiCl extract

之后隨機(jī)選取了含表層蛋白編碼基因的3株瑞士乳桿菌，4株嗜酸乳桿菌，4株卷曲乳桿菌，4株鼠李糖乳桿菌，用LiCl進(jìn)行提取，并用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖2所示。研究表明，大部分乳桿菌表層蛋白的分子量集中于40～50 ku之間[16]，如嗜酸乳桿菌NCFM表層蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大約為46 ku，卷曲乳桿菌K243的表層蛋白分子量為43 ku，干酪乳桿菌zhang的表層蛋白分子量為43 ku。本研究中乳桿菌表層蛋白的條帶也在40～50 ku之間，四種菌均可以觀察到明顯的蛋白條帶，其中，與表層蛋白陽性對(duì)照菌株嗜酸乳桿菌NCFM相似，嗜酸乳桿菌1132、7L5、CCFM720，瑞士乳桿菌D5和D6，卷曲乳桿菌13M4在43～46 ku附近都存在一條明顯的高濃度蛋白條帶，而其他菌株的蛋白條帶亮度則稍弱，表明表層蛋白在菌體中存在但含量較低。這表明攜帶slp基因的菌株可以編碼表層蛋白，但不同菌種、不同菌株之間表層蛋白表達(dá)量是不同的。

2.2 表層蛋白對(duì)乳桿菌菌株特性的影響

表層蛋白對(duì)菌體本身具有重要的意義，它不僅能控制菌體細(xì)胞與外界的聯(lián)系以適應(yīng)環(huán)境的威脅（溶菌酶、高滲透壓、低溫等），還會(huì)影響菌群的生長狀態(tài)[17]。本研究將從生長、自聚集率、自成膜量、與致病菌共聚集率探討去除表層蛋白對(duì)乳桿菌菌體的影響。

2.2.1 表層蛋白對(duì)乳桿菌生長的影響

研究表明，嗜酸乳桿菌ATCC4356經(jīng)5 mol/L氯化鋰溶液去除表層蛋白后菌會(huì)死亡約1個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，瑞士乳桿菌ATCC12046經(jīng)氯化鋰處理后也會(huì)引起1個(gè)log以內(nèi)的損傷[18]。本研究通過測(cè)定5 mol/L的氯化鋰溶液和終濃度0.5 mg/mL蛋白酶溶液處理后乳桿菌的生長狀況，研究表層蛋白的存在與否對(duì)乳桿菌生長是否存在影響，結(jié)果如圖3a所示。4種乳桿菌去除表層蛋白后，菌的生長情況受到了一定程度的影響，且經(jīng)蛋白酶K處理的菌生長能力比經(jīng)氯化鋰處理的菌弱。這可能由于蛋白酶K是廣譜的蛋白質(zhì)去除劑，去除表層蛋白的同時(shí)也去除了其他表面蛋白，故生長過程中需要重新合成大量蛋白質(zhì)，而氨基酸合成會(huì)競爭生長所需要的能量[19]，且經(jīng)蛋白酶K處理的表層蛋白不能重新恢復(fù)，故顯著影響了乳桿菌的生長。而氯化鋰的針對(duì)表層蛋白的專一提取劑，經(jīng)氯化鋰處理的表層蛋白在菌體生長的8 h左右會(huì)重新恢復(fù)[20]，僅在重新合成表層蛋白時(shí)競爭生長的能量。

[2]葉太青：《閩東北片方言語音研究》，福建師范大學(xué)博士論文，2007年，第42-69,69-98頁。

瑞士乳桿菌去除表層蛋白前后生長能力差異很大，但氯化鋰溶液和蛋白酶K兩種溶液處理的差異吸光度值差距較小，差值僅在0.20以內(nèi)，推測(cè)瑞士乳桿菌的表面蛋白主要成分是表層蛋白，因此兩種處理方式下，均去除了表層蛋白，但可能由于瑞士乳桿菌表層蛋白重新合成的速度緩慢，競爭了生長的能量[19]，因而生長情況均低于對(duì)照組。而嗜酸乳桿菌經(jīng)氯化鋰和蛋白酶K兩種溶液處理后生長情況差異較大，吸光度差值高達(dá)0.90，這表明嗜酸乳桿菌經(jīng)氯化鋰處理后表層蛋白在菌體生長過程中快速恢復(fù)，而蛋白酶K處理組不能恢復(fù)，故生長較為緩慢。而卷曲乳桿菌和鼠李糖乳桿菌經(jīng)兩種處理情況后生長情況差異較小，這可能由于這兩種菌有較強(qiáng)的抗逆性，其生長不容易受到影響。因此不論表面是否有表面蛋白類成分的保護(hù)，均能生長。

圖3 表層蛋白對(duì)乳桿菌自身特性的影響Fig.3 The effect of surface layer protein on the characteristics of Lactobacillus

2.2.2 表層蛋白對(duì)乳桿菌自聚集的影響

菌體在生長繁殖過程中出現(xiàn)的大量菌體自發(fā)聚集成團(tuán)的現(xiàn)象被稱為自聚集。乳桿菌的自聚集能力與其黏附性息息相關(guān)，通常自聚集能力強(qiáng)的菌株也具有強(qiáng)黏附性，而表層蛋白會(huì)影響乳桿菌的自聚集能力和黏附能力[21]。Chen等[22]的研究表明卷曲乳桿菌ZJ001去除表層蛋白后其自聚集能力和對(duì)細(xì)胞的黏附能力有所下降，Yong等[8]在無菌小鼠體內(nèi)進(jìn)行嗜酸乳桿菌NCFM的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組分析表明，slpA是無菌小鼠體內(nèi)表達(dá)最高的基因，且輔助表達(dá)表層蛋白功能的slpX也是腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程中轉(zhuǎn)錄較高的基因，說明代謝活躍的細(xì)胞表層在菌株NCFM黏附定植腸道過程中的重要作用。圖3b為氯化鋰溶液和蛋白酶K溶液去除表層蛋白的乳桿菌的自聚集率變化。4種乳桿菌本身具有不同的自聚集能力，其中，鼠李糖乳桿菌的自聚集能力相對(duì)較低，為36%，卷曲乳桿菌的自聚集能力相對(duì)較高，為64.50%。去除表層蛋白后，菌的自聚集能力顯著降低，且蛋白酶K處理后菌的自聚集能力下降程度更大，其中，瑞士乳桿菌去除表層蛋白前后菌體自聚集率差異高達(dá)25%，但兩種溶液處理的差異僅為5%，這也與菌株生長特性的趨勢(shì)相吻合。而卷曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌經(jīng)氯化鋰溶液去除表層蛋白后自聚集率有10%左右的下降，但不如瑞士乳桿菌明顯，而蛋白酶K溶液去除表面蛋白時(shí)自聚集能力有顯著下降，我們推測(cè)，乳桿菌表面其他蛋白質(zhì)在自聚集過程中也起到了重要作用。

2.2.3 表層蛋白對(duì)乳桿菌自成膜的影響

乳桿菌形成生物膜，不僅能夠定植于宿主腸道表面，還能阻擋致病菌的入侵，從而更好的發(fā)揮乳桿菌的益生特性[23]。浦明珠[24]研究對(duì)比了游離細(xì)胞和生物膜菌體的在低酸、高鹽、存在蛋白酶等情況下的活性和存活率，結(jié)果表明生物膜狀態(tài)的菌體的耐受性更高，Kubota等[25]的研究也表明與浮游狀態(tài)相比形成生物膜的植物乳桿菌JCM1149更加耐受有機(jī)酸，乙醇和次氯酸鈉。而不同菌株的成膜能力會(huì)有巨大的差異，比如植物乳桿菌M610成膜能力很強(qiáng)，而植物乳桿菌S061成膜能力卻很弱[26]。本研究通過結(jié)晶紫染色法來判斷不同菌株的成膜能力和表層蛋白對(duì)菌成膜能力的影響，結(jié)果見圖3c。當(dāng)乳桿菌經(jīng)氯化鋰和蛋白酶K處理而失去表層蛋白后，菌的成膜能力大多顯示出下降的趨勢(shì)，尤其是蛋白酶K處理后的菌株。其中，嗜酸乳桿菌JCM1132，鼠李糖乳桿菌2-1經(jīng)氯化鋰去除表層蛋白后出現(xiàn)了極顯著的下降趨勢(shì)，結(jié)晶紫染色的吸光度分別下降了0.80和0.60，而其他菌株則不明顯。

2.2.4 表層蛋白對(duì)乳桿菌與致病菌共聚集的影響

目前，有關(guān)表層蛋白拮抗病原菌的研究主要集中在腸道致病菌方向，而表層蛋白在拮抗口腔致病菌方面益生功能的作用研究尚不多見。早期研究表明口腔中不同種類的細(xì)菌會(huì)出現(xiàn)共聚集的現(xiàn)象，如干酪乳桿菌和變異鏈球菌的在口腔中的共聚集能有效阻止病原菌的結(jié)合或定植，從而降低病原菌的危害性，維護(hù)口腔健康[27]。為了探究表層蛋白對(duì)乳桿菌與致病菌共聚能力的影響，本研究選取致齲性強(qiáng)的變異鏈球菌和白色念珠菌，測(cè)定4種乳桿菌在有無表層蛋白的情況下與致病菌的共聚集能力，從而探究表層蛋白對(duì)乳桿菌與病原菌共聚集的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 表層蛋白對(duì)乳桿菌與致病菌共聚集的影響Fig.4 The effect of surface layer protein on Lactobacillus Co-aggregation with pathogenic organisms

4種乳桿菌在氯化鋰和蛋白酶K剝除表層蛋白前與變異鏈球菌和白色念珠菌混合后都會(huì)產(chǎn)生共聚集現(xiàn)象，有研究表明發(fā)酵乳桿菌421失去表層蛋白前后與鼠傷寒沙門氏菌的共聚集率相差48.27%[14]，開菲爾乳桿菌失去表層蛋白后與沙門氏菌的共聚集能力也有顯著的降低[28]。本研究結(jié)果顯示（圖4），經(jīng)氯化鋰和蛋白酶K處理以去除表層蛋白后，乳桿菌與致病菌的共聚集能力都有了小幅度的下降，且蛋白酶處理比氯化鋰處理所造成的降幅更大，但幾種菌的種間和種內(nèi)差異均不明顯，這可能是由于變異鏈球菌和白色念珠菌本身較強(qiáng)的自聚能力所引起的。有趣的是，鼠李糖乳桿菌3-1與變異鏈球菌和白色念珠菌的共聚集能力是所有菌中最強(qiáng)的，接近90%，且與其他所有菌株都具有顯著性差異（圖4），而其本身的自聚能力僅為36%（圖3b），這表明鼠李糖乳桿菌3-1具有較強(qiáng)的和口腔中的致病菌共聚集能力，有望成為具有防齲潛力的益生菌株。

2.2.5 表層蛋白與菌株特性的熱圖分析

圖5 對(duì)照組，氯化鋰處理組和蛋白酶K處理組的乳桿菌菌株特性熱圖Fig.5 The heatmap of the characteristics ofLactobacillus strains in the control group, the lithium chloride group and the protease K group

為了從總體上探究不同菌株特性與表層蛋白的聯(lián)系，對(duì)4種乳桿菌在對(duì)照組，氯化鋰處理組和蛋白酶K處理組三種狀態(tài)下的菌株特性進(jìn)行了總結(jié)，繪制了熱圖。顏色越接近紅色，表明菌株該特性越強(qiáng)，顏色越接近藍(lán)色，表明菌株該特性越弱。結(jié)果表明，4種乳桿菌本身的菌株特性存在明顯差異，嗜酸乳桿菌生長能力較弱，鼠李糖乳桿菌生長能力較強(qiáng)，鼠李糖乳桿菌3-1自聚能力很弱，但是與致病菌共聚能力很強(qiáng)。LiCl處理會(huì)使大部分菌株的生長，自成膜，自聚集能力下降，蛋白酶K處理降幅更大，這表明在去除表層蛋白后對(duì)菌株的特性產(chǎn)生了一定影響，但影響不如去除細(xì)胞表面相關(guān)蛋白明顯。

3 結(jié)論

本研究通過本地blast對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有基因草圖的菌種進(jìn)行篩選，找到了4株嗜酸乳桿菌、30株卷曲乳桿菌、3株瑞士乳桿菌、30株鼠李糖乳桿菌中均含有slp基因。之后隨機(jī)挑選了四種菌的不同菌株用氯化鋰溶液提取其表層蛋白，用SDS-PAGE鑒定，4種乳桿菌均含有表層蛋白，但含量不同。隨后分析表層蛋白的存在對(duì)菌體生長，自聚集能力，自成膜能力及與致病菌共聚集能力都有不同程度的影響。本研究初步探究了不同種乳桿菌及同種不同菌株的乳桿菌表層蛋白與菌株特性的聯(lián)系，這為將來繼續(xù)研究其他乳桿菌表層蛋白的性質(zhì)及深入分析表層蛋白的其他性質(zhì)和功能提供了一定的理論參考。