黃燕燕，劉冬梅，鄺嘉華，周欽育，陳宇瀚，高璇，塔尼婭，周楊

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

亞硝酸鹽（Nitrite，NIT）是一種在氮循環(huán)中起重 要作用的化合物[1]，作為護(hù)色劑和防腐劑被廣泛用于食品行業(yè)，同時(shí)它可與酯或其他藥用鹽等組合，形成藥制劑[2]。然而，過量攝入亞硝酸鹽會(huì)引起急性中毒等癥狀。目前國家已經(jīng)規(guī)定了亞硝酸鹽在食品中的最大使用量，但由于亞硝酸鹽的不當(dāng)使用、環(huán)境污染以及污染物殘留等原因，導(dǎo)致食品中殘留的亞硝酸鹽偏高[1]，嚴(yán)重危害人們的身體健康。

現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)，生物法降解亞硝酸鹽已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3-5]。例如，乳酸菌和少數(shù)芽孢桿菌等微生物已被證明具有降解亞硝酸鹽的作用，其中，乳酸菌是目前降解亞硝酸鹽最常見的微生物，包括Levilactobacillus brevis、Lactiplantibacillus plantarum等[6]。乳酸菌降解亞硝酸鹽的機(jī)理主要包括酸降解、酶降解和抑制有害菌生長，從而減少亞硝酸鹽的產(chǎn)生[7-11]。楊晶等[7]研究了Lactiplantibacillus plantarum5-7-3在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種有機(jī)酸含量與亞硝酸鹽含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)不同有機(jī)酸對(duì)亞硝酸鹽的降解效果不同，效果最好的是蘋果酸和乳酸，效果最不明顯的是檸檬酸。乳酸菌在發(fā)酵過程中除了可以產(chǎn)生有機(jī)酸之外，還能產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，NiR）來高效降解亞硝酸鹽[8]。盧海強(qiáng)等[9]在從東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中篩選出的多株乳酸菌中分離出了高活力的NiR，推測亞硝酸鹽誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生NiR[10]，但不同乳酸菌分離出的NiR的活性不同。此外，乳酸菌可產(chǎn)生一種叫做細(xì)菌素的蛋白質(zhì)，能夠抑制多種有害菌生長[11]，進(jìn)而抑制硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，故細(xì)菌素的存在能夠抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生，也能防止食品腐敗。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌DMDL 9010（Lactiplantibacillus plantarumDMDL 9010，LP9010）具有高效降解亞硝酸鹽的能力，但其具體機(jī)理尚未明確，尤其是從基因?qū)用嫱诰蚱涓咝Ы到鈦喯跛猁}的基因。本文將通過研究不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分對(duì)LP9010在不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分下理化指標(biāo)（pH、酸度、活菌數(shù)和亞硝酸鹽降解率）的變化，結(jié)合全基因組分析LP9010降解亞硝酸鹽的相關(guān)基因，為植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的機(jī)理提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌DMDL 9010，由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全系篩選分離并保存[12,13]。

MRS肉湯，技術(shù)瓊脂粉，酵母提取粉，購于廣東環(huán)凱微生物科有限公司；無水葡萄糖，蔗糖，亞硝酸鈉，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；對(duì)氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺，濃鹽酸（37%，m/V），硝酸銨，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鉀，磷酸，氫氧化鈉，購于廣州化學(xué)試劑廠；玉米淀粉，大豆蛋白，蘋果，番茄，胡蘿卜，均為食品級(jí)，購于廣州西亞興安超市。其他試劑均為分析純。

超凈工作臺(tái)（MK3型），上海日島科學(xué)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250A-II），韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；高速冷凍離心機(jī)（JW-3021HR），安徽嘉文儀器裝備有限公司；多功能酶標(biāo)儀（680型），美國Bio-Rad公司；pH計(jì)（FiveEasy Plus型），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫干燥箱（DHG-9194A型），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將甘油管中保存的LP9010菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基中（接種量4%，V/V），于37 ℃下活化12 h。

1.2.2 LP9010文庫構(gòu)建、測序與組裝

LP9010基因組DNA由深圳華大基因研究所提取，使用華大基因公司的BGISEQ平臺(tái)和PacBio平臺(tái)進(jìn)行全基因組測序。BGISEQ實(shí)驗(yàn)流程包括用Covaris儀超聲波打斷DNA樣品，獲得符合長度要求的短DNA片段。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit 500 assays試劑盒檢測純化DNA樣品后，進(jìn)行PCR獲得最終文庫并進(jìn)行測序。PacBio平臺(tái)實(shí)驗(yàn)流程包括用g-TUBE將DNA處理成大小適當(dāng)?shù)钠?，使DNA片段形成啞鈴結(jié)構(gòu)的SMRTbell，與聚合酶混合后進(jìn)行測序。對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，保證信息分析結(jié)果可靠性，以得到更精確的組裝結(jié)果。

1.2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

1.2.3.1 不同培養(yǎng)pH對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

用緩沖溶液（2 mol/L磷酸二氫鈉、2 mol/L磷酸氫二鉀、50%磷酸）將MRS液體培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0，設(shè)置自然pH組（pH=5.8）為空白對(duì)照，滅菌。用無菌100 g/L NaNO2溶液調(diào)培養(yǎng)基的NaNO2濃度至0.2 mg/mL（下同），接菌（按4%的接種量接種一次活化后的LP9010，下同）后于37 ℃下培養(yǎng)12 h，于0、4、8、12 h取樣測定活菌數(shù)以及NaNO2降解率。

1.2.3.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

接菌后設(shè)置20、30、37、40和50 ℃下培養(yǎng)12 h，于0、4、8、12 h取樣測定pH值、酸度、活菌數(shù)以及NaNO2降解率（見1.2.4）。

1.2.3.3 氧氣對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

接菌后分別裝于帶封瓶膜的錐形瓶（有氧培養(yǎng)：220 r/min培養(yǎng)）以及帶旋蓋的試劑瓶（無氧培養(yǎng)：靜置培養(yǎng)）中，37 ℃下培養(yǎng)12 h，于0、4、8、12 h取樣測定pH值、酸度、活菌數(shù)以及NaNO2降解率。

1.2.4 不同培養(yǎng)基成分對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

按表1配方配制培養(yǎng)基，其中玉米淀粉組配制方法為：稱取一定量玉米淀粉（5%，m/V）和酵母提取粉（3%，m/V）溶于蒸餾水中，85 ℃攪拌30 min。生長因子組配制方法為：果蔬洗凈去皮后榨成渣（不加水），紗布包住果蔬渣擠出汁液，巴氏殺菌（85 ℃，15 min）。其他步驟相同如下，在蒸餾水中加入碳源、氮源和生長因子配成培養(yǎng)基，滅菌（121 ℃，15 min）冷卻后，再加入0.2 mg/mL NaNO2，接菌后于37 ℃下培養(yǎng)48 h，于0、6、12、24、36、48 h取樣測定菌液的pH值、酸度、活菌數(shù)以及NaNO2降解率。

表1 簡單培養(yǎng)基配方Table 1 Simple medium formulations

1.2.5 理化指標(biāo)的測定

1.2.5.1 pH的測定

用電子pH計(jì)測量。

1.2.5.2 酸度的測定

參考Huang等[14]方法，取1 mL菌液于錐形瓶中，加入兩滴酚酞試劑，用0.10 mol/L NaOH滴定。

式中：

V1——NaOH消耗的體積；

V2——樣品量；

c——NaOH濃度，0.10 mol/L。

1.2.5.3 活菌數(shù)的測定

乳酸菌存活計(jì)數(shù)參考Huang等[14]人的研究并作稍微調(diào)整。將每個(gè)樣品（100 μL）在無菌生理鹽水（0.9%）中進(jìn)行梯度稀釋。將稀釋的100 μL細(xì)菌溶液在MRS瓊脂平板中于37 ℃孵育24 h并計(jì)算乳酸菌菌落數(shù)lg(CFU/mL)。

1.2.5.4 亞硝酸鹽降解率的測定

取樣加2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液混勻，靜置5 min后加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L），加水至刻度搖勻，靜置15 min，在538 nm處測定反應(yīng)液的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.0023X-6×10-5（Y為吸光值，X為亞硝酸鈉含量，回歸系數(shù)R2=0.9971）計(jì)算出亞硝酸鹽的含量（g/L）。

式中：

A——試樣原始亞硝酸鹽含量，g/L；

B——反應(yīng)后亞硝酸鹽含量，g/L。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)，Origin 9.1軟件繪圖。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 LP9010基因組測序分析

由圖1a可知瓊脂糖凝膠電泳得到了一個(gè)1500 bp左右的條帶清晰單一的電泳帶，與課題組前期鑒定結(jié)果相一致[12]。采用深圳華大基因研究所的Illumina平臺(tái)和PacBio RS II平臺(tái)進(jìn)行測序，由于原始測序數(shù)據(jù)可能包含低質(zhì)量序列、接頭序列等，通過過濾雜質(zhì)，從而得到高質(zhì)量Clean Data。根據(jù)平臺(tái)測序結(jié)果進(jìn)行GC-Depth分析，展現(xiàn)樣品的GC含量及深度分布，可以判斷樣品是否有污染以及測序過程的隨機(jī)性等。圖1b可知樣品的GC含量與樣品Depth分析統(tǒng)計(jì)圖符合泊松分布，表明樣品GC含量沒有偏向性，測序隨機(jī)性良好。最后，LP9010的基因組序列提交NCBI，登錄號(hào)為CP063986-CP063988[13]。

圖1 LP9010基因組測序分析Fig.1 The sequencing analysis of LP9010 genome

2.2 不同培養(yǎng)pH對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

根據(jù)圖2，各組pH（由低至高）在12 h時(shí)的亞硝酸鹽降解率分別為100.00、100.00、91.39和82.18%（圖2c）。在4 h時(shí)自然pH組的pH為5.68（圖2a），其亞硝酸鹽降解率（16.18%）低于pH 5.0組（47.11%）（圖2c）；12 h時(shí)自然pH組的pH降為4.02（圖2a），其亞硝酸鹽降解率（90.08%）高于pH 5.0組（82.13%）（圖2c）。這說明pH越低時(shí)亞硝酸鹽降解率越高（pH≥4.00），具有明顯的規(guī)律性。在4 h時(shí)，pH 2.0和pH 3.0組的活菌數(shù)均為0.00 CFU/mL（圖2b），亞硝酸鹽降解率均達(dá)到100.00%（圖2c）。當(dāng)pH＜4.00時(shí)LP9010無法生存（圖2b），此時(shí)亞硝酸鹽主要為酸降解[8]。

圖2 不同培養(yǎng)pH對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響Fig.2 Impact of different culture pH on the nitrite degradation by LP9010

通過查找LP9010全基因組序列（表2）中影響菌株耐酸性相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)LP9010中具有編碼完整的質(zhì)子泵F0F1-ATPase系統(tǒng)的基因以及Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，能夠通過消耗細(xì)胞內(nèi)的ATP將H+泵出細(xì)胞外。此外，谷氨酰胺脫羧酶（GAD）系統(tǒng)和蘋果酸發(fā)酵脫羧過程也與菌株的耐酸性密切相關(guān)[15]，在LP9010中也發(fā)現(xiàn)了谷氨酰胺脫羧酶和精氨酸琥珀酸合酶ASS1。有研究表明基因glnR缺失的菌株在酸性條件下存活率明顯高于正常菌株[16]，在基因組中也找到了與之相關(guān)的基因AGL001420。但是結(jié)合上述菌株酸耐受性實(shí)驗(yàn)分析，LP9010的酸耐受性并不強(qiáng)，在弱酸條件下能夠良好生長，強(qiáng)酸條件下生長受到明顯抑制，從而影響LP9010對(duì)亞硝酸鹽的降解。

表2 LP9010中基因列表Table 2 The lists of Genes in LP9010

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

根據(jù)圖3，相比于其他溫度，37 ℃最適合LP9010生長繁殖、產(chǎn)酸以及降解亞硝酸鹽，此溫度下在培養(yǎng)12 h時(shí)pH最低（4.01）（圖3a）、酸度最高（138.44 °T）（圖3b）、活菌數(shù)最大（1.23×109CFU/mL）（圖3c）以及亞硝酸鹽降解率最高（90.01%）（圖3d）。LP9010正常生長時(shí)產(chǎn)生的酸可以降解亞硝酸鹽[11]，但低溫和高溫均會(huì)抑制LP9010的生長和產(chǎn)酸（圖3），從而抑制亞硝酸鹽的降解。20、30、37、40 ℃組的酸度變化均為先下降后上升，這是因?yàn)樗釙?huì)通過下述反應(yīng)降解亞硝酸鹽[17]：H++NO2-→HNO2（對(duì)熱不穩(wěn)定）→N2O3（對(duì)熱不穩(wěn)定）→NO+NO2。在生長前期LP9010生長繁殖緩慢，分泌有機(jī)酸的速率低于其被消耗的速率，酸度下降；后期LP9010繁殖速度加快，有機(jī)酸分泌速率高于其被消耗的速率，酸度上升。

此外，在LP9010中還發(fā)現(xiàn)一些與冷熱耐受性相關(guān)的基因（表3），例如與耐熱相關(guān)的clp蛋白酶亞單位基因cplC、clpE、clpP、clpX和clpL等，編碼冷應(yīng)激蛋白cspA（AGL000029、AGL000821和AGL000956）的基因等。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)菌株冷熱耐受性分析，推測在20 ℃和40 ℃條件下培養(yǎng)8 h后菌株生長速度加快與菌株冷熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)有關(guān)，在低溫和高溫的刺激下，應(yīng)激蛋白的表達(dá)提高了菌株對(duì)極端溫度的耐受性。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響Fig.3 Impact of different culture temperatures on the nitrite degradation by LP9010

表3 LP9010中基因列表Table 3 The lists of Genes in LP9010

表4 LP9010中基因列表Table 4 The lists of Genes in LP9010

2.4 氧氣對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

由圖4，12 h時(shí)有氧組和無氧組的pH分別為4.01和3.99（圖4a），酸度分別為138.44 °T和144.95 °T（圖4b），活菌數(shù)分別為1.28×109CFU/mL和7.40×108CFU/mL（圖4c），亞硝酸鹽降解率分別為90.12%和92.87%（圖4d）?？煽闯龈黜?xiàng)指標(biāo)無明顯差異（p＞0.05），這是因?yàn)槿樗峋拇x類型為兼性厭氧，有無氧氣下均可正常生長繁殖[18]。但氧氣的存在可能會(huì)影響其代謝過程，故兩組的產(chǎn)酸以及亞硝酸鹽降解率均有細(xì)微差別。在LP9010全基因組（表4）中，發(fā)現(xiàn)了與過氧化氫還原酶表達(dá)相關(guān)的基因AGL003162和與超氧化物歧化酶表達(dá)相關(guān)的基因AGL001327。在硫化物代謝過程中發(fā)現(xiàn)了由AGL000611和AGL002295編碼的硫氧還蛋白還原酶trxB，由AGL000220、AGL002017、AGL002333、AGL003045和AGL003275編碼的硫氧還蛋白trxA，trxB和trxA在抵抗氧化應(yīng)激中產(chǎn)生重要作用[19]。在谷胱甘肽代謝途徑中發(fā)現(xiàn)了編碼谷胱甘肽還原酶gor的基因，該酶能夠?qū)⒐入赘孰亩蚧镞€原為谷胱甘肽（GSH），GSH通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控清除自由基以提升氧耐受性。此外，基因AGL002068編碼的L-甲硫氨酸（R）-S-氧化物還原酶msrC、基因AGL001131、AGL001649和AGL001772編碼的肽-甲硫氨酸（S）-S-氧化物還原酶msrA和基因AGL001650編碼的肽-甲硫氨酸（R）-S-氧化物還原酶msrB能夠有效降低過氧化氫對(duì)菌株的損傷。結(jié)合氧氣對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株生長情況影響的分析，推測LP9010的氧氣耐受性可能與上述超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等酶類的表達(dá)有關(guān)，接下來仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 不同碳源對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

在乳酸菌降解亞硝酸鹽的代謝過程中，糖類物質(zhì)除了發(fā)揮提高肉制品的風(fēng)味和色澤的作用外，還是乳酸菌代謝過程中所需的碳源，因此它直接影響著乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解。從圖5可看出空白組、葡萄糖組、蔗糖組和玉米淀粉組的pH變化無明顯差異（p＞0.05），均為先下降后稍有回升（圖5a）；酸度較低，均在6.00 °T以下（圖5b）；四組的活菌數(shù)先上升，在6 h時(shí)升至最高值（3.19×107CFU/mL）后快速下降，其中玉米淀粉組的活菌數(shù)在24 h時(shí)降為0.00 CFU/mL，而其他三組的活菌數(shù)在12 h時(shí)降為0.00 CFU/mL（圖5c）。在48 h時(shí)空白組、葡萄糖組和蔗糖組的亞硝酸鹽降解率在25.00%以下，玉米淀粉組的亞硝酸鹽降解率為50.59%（圖5d）。由于糊化玉米淀粉易吸收，且含有脂肪、蛋白質(zhì)、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)[20]，故玉米淀粉組中LP9010存活時(shí)間較長。在培養(yǎng)前期（0～12 h）LP9010利用糖份快速生長產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH快速下降（圖5a）；但12 h之后活菌數(shù)開始下降，產(chǎn)酸減少，而酸被消耗用于降解亞硝酸鹽，故pH略有上升[20]?？瞻捉M、葡萄糖和蔗糖組LP9010存活時(shí)間較短（12 h）（圖5c），導(dǎo)致亞硝酸鹽降解率較低；相比于其他組，玉米淀粉組中LP9010能更好地生長繁殖，因此亞硝酸鹽降解率在48 h時(shí)明顯高于其他組（p＜0.05）（圖5d）。LP9010基因序列（表5）中pst I（PTS system enzyme I）由基因AGL001080編碼，未發(fā)現(xiàn)編碼HPr的相關(guān)基因。糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因中，葡萄糖家族由EII A的Crr和EII B的NagE等轉(zhuǎn)運(yùn)，蔗糖由EII BCA的ScrA轉(zhuǎn)運(yùn)，甘露糖由EII A的MtlA和ManX、EII B的ManY和EII D的ManZ轉(zhuǎn)運(yùn)，半乳糖由EII A的GatA、EII B的GatB和EII C的GatC轉(zhuǎn)運(yùn)，果糖由EII B的FruA和EII A的FruB轉(zhuǎn)運(yùn)。葡萄糖和蔗糖組降亞硝酸鹽率無明顯差異（p＞0.05，圖5），在整個(gè)LP9010的PTS系統(tǒng)中，只有蔗糖、甘露糖、半乳糖胺、半乳糖和果糖具有完整的代謝通路，這與表型（葡萄糖、蔗糖組）結(jié)果相一致。

圖4 氧氣對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響Fig.4 Impact of oxygen on the nitrite degradation by LP9010

圖5 不同碳源對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響Fig.5 Impact of different carbon sources on the nitrite degradation by LP9010

表5 LP9010中基因列表Table 5 The lists of Genes in LP9010

圖6 不同氮源對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響Fig.6 Impact of different nitrogen sources on the nitrite degradation by LP9010

表6 LP9010中基因列表Table 6 The lists of Genes in LP9010

2.6 不同氮源對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

由圖6，硝酸銨組中LP9010無法繁殖和產(chǎn)酸，pH保持在5.07～5.41內(nèi)（圖6a）、酸度在18.89～24.89 °T間（圖6b）、活菌在0～6 h維持在6.50×105CFU/mL左右（圖6c），在12 h時(shí)下降至0.00 CFU/mL（圖6c），可見LP9010不能以硝酸銨為氮源，且對(duì)LP9010產(chǎn)生毒害作用[20]。其原因可能是高濃度無機(jī)鹽使溶液滲透壓變大，細(xì)胞失水營養(yǎng)物質(zhì)流失，致使細(xì)胞皺縮，阻礙其生長過程。故此時(shí)LP9010無法生長和產(chǎn)酸，亞硝酸鹽幾乎不降解。在葡萄糖的基礎(chǔ)上添加酵母提取粉能提升LP9010的生長繁殖和產(chǎn)酸，故亞硝酸鹽降解率高；大豆蛋白組雖產(chǎn)酸少，但亞硝酸鹽降解率在48 h時(shí)可達(dá)到85.62%（圖6d），可能是因?yàn)長P9010能產(chǎn)生其他能降解亞硝酸鹽的物質(zhì)（如NiR等）。另外，本實(shí)驗(yàn)也從側(cè)面證實(shí)了乳酸菌不能利用亞硝酸鹽作為提供其細(xì)胞生長所需的氮源或無機(jī)鹽。有趣的是，筆者在LP9010中發(fā)現(xiàn)了推定的亞硝酸鹽還原酶基因，例如lmrB和pgl（表6）。此外，植物乳桿菌WCFS1在KEGG途徑和NCBI中發(fā)現(xiàn)的谷氨酸和谷氨酰胺代謝中顯示關(guān)鍵酶。本課題組前期研究表明，LP9010通過電子傳輸鏈降解了低濃度的亞硝酸鹽（0.276 g/L），部分亞硝酸鹽被還原為NH3[21]，但是亞硝酸鹽還原酶能否在降解過程中起主導(dǎo)作用仍需進(jìn)一步研究。

2.7 不同生長因子對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響

由圖7，不同生長因子對(duì)LP9010的產(chǎn)酸以及亞硝酸鹽降解率無明顯影響（p＞0.05）（圖7a和d）。三組pH（圖7a）和酸度（圖7b）的變化無明顯差異，亞硝酸鹽降解率趨勢相近，在24 h時(shí)均達(dá)到100.00%（圖7d）。而添加番茄汁12 h后活菌數(shù)（3.95×109CFU/mL）會(huì)明顯高于蘋果汁組（5.10×108CFU/mL）和胡蘿卜汁組（8.70×108CFU/mL），但24 h時(shí)番茄汁組的活菌數(shù)會(huì)下降到與其他兩組相同的水平（7.23×108CFU/mL）（圖7c），這與杜磊[22]人的研究結(jié)果一致，說明不同生長因子下LP9010產(chǎn)酸無明顯差別，亞硝酸鹽降解率也相近。在LP9010的全基因組序列中未發(fā)現(xiàn)維生素消化和吸收的相關(guān)編碼基因（KEGG代謝通路為ko04977）。沙吉坦穆·克依斯?fàn)柕热藦膩碜詡鹘y(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中篩選出短乳桿菌（Levilactobacillus brevis）M3-3，探究不同促生長因子（番茄汁、胡蘿卜汁、玉米漿）對(duì)Levilactobacillus brevisM3-3生長的影響，發(fā)現(xiàn)玉米漿對(duì)Levilactobacillus brevisM3-3的促生長效果最好[23]，與本研究結(jié)果不同，可能是菌株的差異性所導(dǎo)致的。然而不同乳桿菌是否含有維生素消化和吸收的相關(guān)編碼基因會(huì)影響乳桿菌的生長，仍需進(jìn)一步的研究。

圖7 不同生長因子對(duì)LP9010降解亞硝酸鹽的影響Fig.7 Impact of different growth factors on the nitrite degradation by LP9010

3 結(jié)論

本文在不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分條件下培養(yǎng)LP9010，通過研究和分析其pH、酸度、活菌數(shù)和亞硝酸鹽降解率的變化可知：pH越低時(shí)亞硝酸鹽降解率越高；37 ℃最有利于LP9010生長繁殖和產(chǎn)酸，從而更好地降解亞硝酸鹽，溫度升高或者降低使得亞硝酸鹽降解率下降；不同培養(yǎng)基成分對(duì)LP9010降亞硝酸鹽的影響主要體現(xiàn)在增菌作用，活菌數(shù)越高，亞硝酸鹽降解率越高。通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)LP9010中有酸耐受，冷熱耐受，氧耐受以及糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，尤其是發(fā)現(xiàn)了亞硝酸鹽還原酶基因。然而LP9010降解亞硝酸鹽深層次的機(jī)理仍有待進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析驗(yàn)證相關(guān)基因與亞硝酸鹽降解的相關(guān)性。