毛丙永，崔樹茂*，潘明羅，黃潔，王健，吳晚生，郭仁妹，趙建新

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）（2.蘇州硒泰克生物科技有限公司，江蘇蘇州 215000）

人體腸道內(nèi)寄居著大量的微生物，種類超過1000種[1]。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群在人體健康許 多方面起了關(guān)鍵作用，包括免疫、代謝和神經(jīng)行為特征[2]。腸道細(xì)菌可以發(fā)酵一些不可消化的底物，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，并產(chǎn)生多種氣體，包括氫氣、硫化氫、二氧化碳、甲烷等，其中氫氣在胃腸道菌群能量代謝中具有能量轉(zhuǎn)化作用。許多對人類營養(yǎng)、疾病和健康密切相關(guān)的細(xì)菌的代謝通路均涉及到氫氣[3]。

腸道菌群組成處于一個不斷變化的動態(tài)平衡中，人體基因、飲食、環(huán)境及抗生素使用等，均會對腸道菌群組成產(chǎn)生一定程度上的影響。當(dāng)飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，腸道菌群也會快速響應(yīng)發(fā)生變化[4]，如食用抗性淀粉在某些人中可以提高青春雙歧桿菌、直腸真細(xì)菌等的豐度[5]。腸道菌群組成的改變與一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)。如一些腸道細(xì)菌可以代謝膳食中的膽堿產(chǎn)生三甲胺，在肝臟內(nèi)被轉(zhuǎn)化成氧化三甲胺，與患動脈粥樣硬化的風(fēng)險增加呈正相關(guān)[6]；Baothman等[7]研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在肥胖的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，腸道菌群失調(diào)可能通過多種機制促進飲食誘發(fā)的肥胖和代謝并發(fā)癥。

益生元一般指不能被人體所消化吸收但可被人體微生物選擇性利用，能夠改善腸道微生物組成和活性從而益于人體健康的食物成分[8]，促進腸道內(nèi)有益菌的增殖，從而調(diào)節(jié)腸道菌群。益生菌是一類活的微生物，當(dāng)攝入足夠量時，會對宿主健康產(chǎn)生有益作用[9]。目前，益生菌主要是一些雙歧桿菌和乳桿菌，可以存在于固體飲料、發(fā)酵乳制品、膳食補充劑或藥物等多種產(chǎn)品中。一方面，益生菌能夠在腸道內(nèi)穩(wěn)定定殖，調(diào)節(jié)腸道菌群組成[10]；另一方面，益生菌通過發(fā)酵未被消化的碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸，為腸上皮細(xì)胞提供能量，進而影響腸上皮屏障和調(diào)節(jié)天然免疫細(xì)胞及T細(xì)胞、B細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫。

目前，針對一些腸道菌群紊亂相關(guān)的疾病治療中，通常會采用多種益生菌進行組合，或者結(jié)合益生菌和益生元進行干預(yù)，以提高干預(yù)效果。本實驗擬開展一種復(fù)合益生菌制劑的人群干預(yù)研究，通過高通量測序技術(shù)分析干預(yù)前后志愿者的腸道菌群組成，評價該復(fù)合益生菌制劑的干預(yù)效果，為益生菌制劑的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復(fù)合益生菌制劑，包括低聚果糖（40%）、菊粉（50%）、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌，其總活菌數(shù)為100億CFU/袋，購自蘇州硒泰克生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒Fast DNA Spin Kit for feces，購自美國MP Biomedicals公司；2×Taq master mix預(yù)混液，購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物（341F和806R）、瓊脂糖，購自生工生物工程（上海）有限公司；膠回收試劑盒，購自杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；Qubit dsDNA BR reagent染料，美國Life Invitrogen公司；TruSeq DNA HT Sample Preparation Kit、KAPA biosystems library quantification Kit試劑盒、上機測序試劑盒MiSeq Reagent Kit v3，購自美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

快速核酸提取儀FastPrep-24，美國MP公司；超低溫冰箱，美國Thermo Scientific公司；冷凍離心機，德國Eppendorf公司；PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；UV-2000切膠儀，上海天能科技有限公司；Qubit 3.0熒光定量儀，美國Life Invitrogen公司；MiSeq測序儀，美國Illumina公司；Agilent Bioanalyzer 2100，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 志愿者招募及干預(yù)

本實驗共招募15名志愿者（7名男性，8名女性），年齡在50～70歲之間（平均年齡為61.5歲）。每天采用溫水服用1袋復(fù)合益生菌制劑（3 g/袋），連續(xù)服用28 d，服用前與連續(xù)服用28 d后分別收集糞便，儲藏于-80 ℃，備用。

1.3.2 細(xì)菌基因組的提取

參照Hanskia等[11]的方法，按照Fast DNA Spin Kit for feces試劑盒的說明書提取糞便樣品中的細(xì)菌基因組，并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.3 細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)的PCR擴增

以提取的細(xì)菌基因組為模板，采用引物（341F：CCTAYGGGRBGCASCAG，806R：GGACTACNNGG GTATCTAAT），擴增16S rDNA的V3-V4區(qū)，片段大小為466 bp。不同樣品用7個堿基組成的barcode（5’-端）進行區(qū)分，反應(yīng)體系為（50 μL）：模板1 μL，上游引物341F：0.5 μL，下游引物806R：0.5 μL，2×Taq PCR Mix預(yù)混液25 μL，雙蒸水23 μL。

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s→52 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，12 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，時間60 min。電泳結(jié)束后，進行膠回收與定量。

1.3.4 V3-V4區(qū)PCR產(chǎn)物的膠回收與定量

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳獲得帶目的條帶的膠體，利用切膠儀將目的片段（466 bp）切下，按照膠回收試劑盒的說明書回收PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物回收后，保存于-20 ℃冰箱備用。

純化后的DNA，按照Qubit 3.0熒光定量儀的說明書測定其濃度（ng/μL）。

1.3.5 文庫構(gòu)建與上機測序

根據(jù)DNA濃度的定量結(jié)果，按等質(zhì)量濃度混合樣品，總體積為50 μL，樣品總量為200 ng，樣品數(shù)量＜50。按照TurSeq DNA HT Sample Preparation Kit試劑盒說明書構(gòu)建文庫，主要包括末端修復(fù)、3’端加A、接頭連接以及PCR擴增等步驟。

文庫構(gòu)建后，采用Agilent Bioanalyzer 2100生物分析儀測定DNA片段大小，然后利用KAPA biosystems library quantification kit試劑盒說明書精確測定DNA的濃度，然后將構(gòu)建好的文庫經(jīng)過稀釋、變性，最后加入已融化的上機試劑盒MiSeq Reagent Kit v3，MiSeq測序儀上機測序。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

測序完成后，使用簡單的unix命令按照barcode序列將下機數(shù)據(jù)拆分成單個樣品的fastq文件，利用cutadapt軟件去除V3-V4區(qū)域擴增的引物，Qiime2-DADA2包對測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，包括過濾有噪聲的序列、矯正錯誤序列、去除嵌合體序列以及去除出現(xiàn)一次的低頻序列，最后合并降噪后的雙端序列。DADA2對去噪的序列直接去冗余形成相似度為100%的features。通過Ribosomal Database Project (RDP) Naive Bayes classifier[12]鑒定OTU種系型。

利用greengenes數(shù)據(jù)庫與序列進行比對，采用FastTree構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定腸道菌群物種。繪制稀釋曲線，計算樣品的α-多樣性和β-多樣性；采用主坐標(biāo)分析（Pricipal Coordinates Analysis，PCoA）可以直觀反映腸道微生物群落整體差異，樣本組成越相似，其在PCA圖上的距離越近[13]；腸道菌群特定差異菌屬利用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)大?。╡ffect size，LEfSe）進行分析探究。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

圖1 稀釋曲線Fig.1 The rarefaction curve

本實驗共收集30份糞便樣品，其中復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前樣品15份，干預(yù)后樣品15份。通過MiSeq高通量測序，30個樣品共產(chǎn)生623,655條高質(zhì)量的16S rDNA的V3-V4區(qū)序列，平均每個樣品20,788條，共產(chǎn)生733個features，由測序深度與觀測到的物種數(shù)量制作的稀釋曲線如圖1所示。在本實驗當(dāng)前測序量下，樣品的稀釋曲線進入平臺期，表明測序深度已經(jīng)能夠滿足本實驗菌群分析的目的。

2.2 糞便菌群的α多樣性分析和PCoA分析

圖2所示為糞便菌群的α多樣性分析，包括Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)，并用Anova檢驗方法進行差異顯著性檢驗。由Shannon指數(shù)箱線圖（圖2a）可知，復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前后，腸道菌群的Shannon指數(shù)未發(fā)生顯著改變（p=0.47），這說明干預(yù)前后腸道微生物的多樣性無發(fā)生顯著性的差異；由Eveness指數(shù)圖可知，復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前后樣品的均勻度也未發(fā)生顯著改變（p=0.48），進一步說明復(fù)合益生菌制劑對個體的均勻程度影響較小。

圖2 樣品的α多樣性-Shannon指數(shù)箱線圖（a）和Eveness指數(shù)箱線圖（b）Fig.2 Theα-diversity of samples including Shannon index (a) and Eveness index (b)

基于加權(quán)UniFrac距離、未加權(quán)UniFrac距離和Bray算法對所有樣品的菌群數(shù)據(jù)進行PCoA分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前，15名志愿者的樣品在PCoA圖中分布較為離散。在3種不同算法下得到一致的結(jié)果，表明腸道菌群存在明顯的個體差異性。復(fù)合益生菌制劑干預(yù)后，15名志愿者的樣品在PCoA圖中分布較為聚集，并未明顯分開，這可能是由于干預(yù)時間比較短導(dǎo)致的。

圖3 基于加權(quán)UniFrac的PCoA主坐標(biāo)分析圖（a）、未加權(quán)UniFrac的PCoA主坐標(biāo)分析圖（b）和基于Bray算法（c）的PCoA主坐標(biāo)分析圖Fig.3 The PCoA analysis based on the weighted UniFrac distance (a), the PCoA analysis based on unweighted UniFrac distance (b) and the PCoA analysis based on Bray distance (c)

2.3 復(fù)合益生菌制劑干預(yù)對腸道菌群組成的影響

在門水平上，志愿者糞便樣品中共檢測到7個門，包括放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、柔壁菌門（Tenericutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）（圖4）。復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前，志愿者的腸道菌群中相對豐度最大的是厚壁菌門（68.5%），其次是放線菌門（15.2%），變形菌門（10.6%）和擬桿菌門（5.5%）。復(fù)合益生菌制劑干預(yù)后，糞便樣品中厚壁菌門和放線菌門的相對豐度增加，但無統(tǒng)計學(xué)顯著性，這可能與制劑中主要包括乳桿菌和雙歧桿菌有關(guān)，乳桿菌屬于厚壁菌門，而雙歧桿菌屬于放線菌門。此外復(fù)合益生元制劑中含有菊粉和低聚果糖能有效提高放線菌門的豐富度[14]。而復(fù)合益生菌制劑干預(yù)后，糞便中擬桿菌門和變形菌門的相對豐度減少，但無顯著性差異。先前研究表明一型糖尿病患者中擬桿菌門的豐富度明顯增加，這會影響宿主TLR2/TLR4基因的表達(dá)[15]。因此，降低擬桿菌門有利于改善宿主健康。

圖4 復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前后腸道菌群組成的變化（門水平）Fig.4 Changes in the composition of intestinal microbiota at the phylum level before and after compound probiotics intervention

圖5 復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前后腸道菌群組成的變化（屬水平）Fig.5 Changes in the composition of intestinal microbiota at the genus level before and after compound probiotics intervention

在屬水平上，糞便樣品中共檢測到143個屬，其中相對豐度在前25位的屬的變化如圖5所示，其中20個屬的相對豐度在1%以上。復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前，志愿者糞便菌群中相對豐度最大的屬為布勞特氏菌屬（Blautia，17.0%），這是一個較為新興的物種分類，廣泛存在于哺乳動物的糞便和腸道中，其豐度與慢性疾病包括炎癥性腸病、結(jié)腸癌、肥胖、糖尿病等密切相關(guān)[16-19]，其次為雙歧桿菌屬（Bifidobacterium，12.7%），鏈球菌屬（Streptococcus）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella，7.3%）、羅姆布茨菌(Romboutsia，5.0%）、擬桿菌屬（Bacteroides，4.2%）、霍氏真桿菌屬(Eubacteriumhalliigroup，3.5%）和乳桿菌屬（Lactobacillus，3.5%）也具有較高的相對豐度。復(fù)合益生菌制劑干預(yù)后，布勞特氏菌屬的相對豐度降低（由17.0%降至16.3%），12個屬的相對豐度增加，包括霍氏真桿菌屬、棒狀菌屬（Anaerostipes）、柯林斯菌屬（Collinsella）、多爾氏菌屬（Dorea）、丹毒絲菌屬（Erysipelotrichaceae UCG-003）、真細(xì)菌屬（Eubacterium）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）、紡錘鏈桿屬（Fusicatenibacter）、乳桿菌屬、瘤胃球菌屬和鏈球菌屬。乳桿菌屬相對豐度的增加，對宿主健康會產(chǎn)生有益的影響；柔嫩梭菌屬相對豐度的增加能提高腸道內(nèi)丁酸含量，改善腸道炎癥[20]。然而，這些屬相對豐度的增加并不顯著。

圖6 復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前后腸道菌群發(fā)生顯著變化的種屬分析-LEfSe分析Fig.6 Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis of the different intestinal microbiota before and after compound probiotics intervention

由LEfSe分析（圖6）可知，復(fù)合益生菌制劑干預(yù)后，Chloroplast（目）、Cyanobacteria（門）和Oxyphotobacteria（綱）的相對豐度顯著高于干預(yù)前，而Dialister（屬）、Veillonellaceae（科）、Selenomonadales（目）和Negativicutes（綱）的相對豐度顯著低于干預(yù)前。先前研究發(fā)現(xiàn)，Cyanobacteria在高脂飲食小鼠中具有較低豐富度，因此，高豐富度Cyanobacteria可能會增加患高血脂癥的風(fēng)險[21]。

2.4 復(fù)合益生菌制劑干預(yù)對腸道內(nèi)產(chǎn)氫氣細(xì)菌相對豐度的影響

圖7 復(fù)合益生菌制劑干預(yù)前后腸道內(nèi)主要產(chǎn)氫氣屬的相對豐度變化Fig.7 Changes in the relative abundance of the hydrogen-producing bacteria in the intestinal tract before and after compound probiotics intervention

除雙歧桿菌屬和乳桿菌屬外，腸道內(nèi)還有一些產(chǎn)氫氣的細(xì)菌對宿主健康具有重要的影響。根據(jù)Wolf等人[22]的研究，并結(jié)合《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》（《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》）[23,24]，分析了腸道內(nèi)主要產(chǎn)氫氣細(xì)菌的相對豐度的變化，主要包括柯林斯菌屬（Collinsella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、多爾氏菌屬、羅斯氏菌屬（Roseburia）、韋榮球菌屬（Veillonella）、斯萊克氏菌屬（Slackia）和真細(xì)菌屬（Eubacterium）等8個屬。復(fù)合益生菌制劑干預(yù)后，糞便樣品中雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、柯林斯菌屬、瘤胃球菌屬、多爾氏菌屬和真細(xì)菌屬的相對豐度增加，但增加不顯著。然而，梭狀芽孢桿菌屬、羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬和斯萊克氏菌屬的相對豐度減少，但無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

以上結(jié)果表明，復(fù)合益生菌制劑干預(yù)會改變腸道菌群組成，其中雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、柯林斯菌屬、瘤胃球菌屬、多爾氏菌屬Dorea和真細(xì)菌屬相對豐度增加，但存在個體差異。

3 結(jié)論

本文通過分析15名志愿者在服用復(fù)合益生菌制劑前后的腸道結(jié)構(gòu)的變化，探索復(fù)合益生菌制劑對腸道菌群結(jié)果的影響。服用復(fù)合益生菌制劑能改變腸道內(nèi)一些微生物的豐富度，對腸道內(nèi)一些產(chǎn)氫氣細(xì)菌的豐度產(chǎn)生影響，但無統(tǒng)計學(xué)顯著性，這可能與其干預(yù)時間有關(guān)系。且由于個體腸道菌群差異以及一些不可控因素的存在，人群干預(yù)實驗的檢測指標(biāo)通常具有較大的離散性、差異較大，但積極開展人群干預(yù)實驗對于產(chǎn)品開發(fā)與評價，具有非常重要的指導(dǎo)意義。