覃茜

（百色市婦幼保健院，廣西 百色，533000）

出生缺陷的發(fā)生已受到我國(guó)重點(diǎn)關(guān)注，主要是指胚胎或胎兒在發(fā)育期間，所出生結(jié)構(gòu)或功能代謝異常，主要包括染色體異常、先天畸形、遺傳代謝性疾病以及功能異常。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)出生缺陷發(fā)生率可達(dá)到4%—6%，已被歸納為高發(fā)國(guó)家[1]。目前，臨床針對(duì)該類疾病我國(guó)醫(yī)學(xué)界尚無(wú)最佳治療措施，一般通過(guò)染色體疾病的產(chǎn)前篩查及診斷，盡早判斷出生缺陷疾病，同時(shí)利用早期干預(yù)或終止妊娠，來(lái)規(guī)避出生缺陷發(fā)生率[2]。既往，臨床以血清學(xué)篩查、超聲產(chǎn)前診斷以及侵入性產(chǎn)前診斷為胎兒染色體疾病常用手段，其中超聲診斷項(xiàng)目包括多類，如三級(jí)彩超篩查、胎兒頸項(xiàng)透明層（NT）檢查[3]。而血清學(xué)主要于孕早期或孕中期，利用檢測(cè)孕婦血清學(xué)生化標(biāo)志物+NT，并依據(jù)孕周、體重、糖尿病史、吸煙史等因素，綜合性判斷胎兒染色體疾病[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清篩查檢出率為60%—70%，但其漏檢率普遍較高，進(jìn)而增加唐氏綜合征患兒出生風(fēng)險(xiǎn)[5]。侵入性產(chǎn)前診斷可歸納為絨毛活檢、羊膜腔穿刺以及臍靜脈穿刺，均屬于創(chuàng)傷性診斷，且伴有實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，且具有0.5%—1%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此提供一類檢出率高、無(wú)創(chuàng)的診斷措施，已成為臨床醫(yī)師探究的熱點(diǎn)。而染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（NIPT）屬于一類新型技術(shù)，也是基于孕婦外周血中胎兒游離DNA 新型產(chǎn)前篩查技術(shù)，通過(guò)采集孕婦靜脈血，分離血漿，并提取血漿內(nèi)游離DNA，通過(guò)高通量基因測(cè)序措施，實(shí)施深度測(cè)序，同時(shí)依據(jù)生物信息學(xué)探究技術(shù)，判斷胎兒患染色體異常疾病風(fēng)險(xiǎn)。本文對(duì)NIPT 原理、優(yōu)勢(shì)依據(jù)局限性進(jìn)行綜述如下：

1 NIPT 原理

相關(guān)學(xué)者于1997 年發(fā)現(xiàn)，通過(guò)常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），母體外周血血漿內(nèi)Y 染色體特異DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增，證實(shí)母血漿內(nèi)伴有胎兒游離DNA，進(jìn)而開(kāi)展了通過(guò)母血中胎兒游離DNA（cell－free fetal DNA，cffDNA）實(shí)施無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷新途徑[7]。另學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，以孕婦血中胎兒游離DNA 為模板，通過(guò)全基因組，大規(guī)模平行基因檢測(cè)測(cè)序技術(shù)對(duì)胎兒21 染色體非整倍體實(shí)施研究，為NIPT 開(kāi)辟重要途徑[8]。孕婦外周血血漿內(nèi)游離NDA屬于胎兒及母體游離DNA 的混合物，該指標(biāo)的來(lái)源，以母體自身細(xì)胞降解為主，極少部分屬于凋亡胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，該類細(xì)胞釋放NDA，能夠?yàn)樘哼z傳物質(zhì)游離DNA 片段扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，于妊娠7 周胎盤循環(huán)建立后，即可于孕婦外周中判斷穩(wěn)定cffDNA，其濃度可依據(jù)孕周增大，而隨著上升，且平均半衰期為16min，于正常分娩2h 后，于母體外周血中尚未檢出，故本次妊娠實(shí)施產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果，未受到上次妊娠干擾[9]。同時(shí)胎兒游離DNA 均以小片段形成存在，平均為166bp。結(jié)合胎兒游離NDA 以上特點(diǎn)，使孕婦外周胎兒游離DNA 實(shí)施產(chǎn)前篩查，成為可能。

2 NIPT 檢測(cè)平臺(tái)

NIPT 的建立，與高通量測(cè)序技術(shù)存在密切聯(lián)系。現(xiàn)階段，應(yīng)用于NIPT 檢測(cè)項(xiàng)目高通量測(cè)序技術(shù)已逐漸完善，以Illumina、Ion Torrent 以及BGI 三大平臺(tái)為核心，其中Illumina 通過(guò)邊和成邊測(cè)序方式，利用橋式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和可逆性末端總結(jié)作為關(guān)鍵技術(shù)，測(cè)序期間需將基因組DNA 隨機(jī)片段合理放置光學(xué)透明玻璃表面，該類DNA 片段可經(jīng)過(guò)延伸和橋式PCR 擴(kuò)張后，于Flow cell 上形成數(shù)以億計(jì)的DNA簇，且具有數(shù)千份一致模板單分子簇[10]。同時(shí)能夠通過(guò)帶熒光基團(tuán)的4 類特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止SBS 技術(shù)，對(duì)待測(cè)模式DNA 實(shí)施側(cè)訊，以文庫(kù)構(gòu)建簡(jiǎn)單為主要特點(diǎn)，且無(wú)需實(shí)施PCR 環(huán)節(jié)，錯(cuò)誤率較低，測(cè)通量大，以測(cè)序讀長(zhǎng)較短[11]。而Ion Torrent 屬于一類尚無(wú)光學(xué)感應(yīng)的測(cè)序項(xiàng)目，通過(guò)半導(dǎo)體測(cè)序?yàn)楹诵?，選擇一類布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，每個(gè)小孔就有一個(gè)測(cè)序反應(yīng)池，若一個(gè)受到單克隆序列，覆蓋磁珠而進(jìn)入小孔后，開(kāi)始測(cè)序反應(yīng)，可依據(jù)順序一次流經(jīng)4 種堿基[12]。若產(chǎn)生堿基插入時(shí)，PH 變化，可受到反應(yīng)池感應(yīng)器所感應(yīng)，將化學(xué)信號(hào)逐漸轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，進(jìn)而讀取DNA 序列，其以測(cè)序速度快為優(yōu)勢(shì)，以單個(gè)堿基重復(fù)問(wèn)題為缺陷。BGI 通過(guò)DNA納米球（DNA Nanoball，DNB）配合探針錨定聚合測(cè)序（cPAS）技術(shù)，通過(guò)一類經(jīng)特殊表面修飾規(guī)則陣列芯片，每個(gè)修飾位點(diǎn)固定于一個(gè)DNA 納米球，陣列芯片修飾位點(diǎn)距離一致，能夠確保不同納米球光信號(hào)未互相影響，進(jìn)而強(qiáng)化信號(hào)處理的合理性，以準(zhǔn)確性高、測(cè)序通量大為優(yōu)勢(shì)[13]。

3 NIPT 應(yīng)用狀況及局限性

3.1 應(yīng)用指征(1)孕早期、孕中期血清學(xué)篩查，反映胎兒染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而被歸納為臨界高風(fēng)險(xiǎn)孕婦。（2）屬于感染性疾病活動(dòng)期，介入性產(chǎn)前診斷禁忌者[14]。（3）伴有習(xí)慣性流產(chǎn)、試管嬰兒等孕婦，且在知曉同意下，可選擇無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)；（4）孕周過(guò)大，錯(cuò)過(guò)現(xiàn)階段產(chǎn)前診斷最佳時(shí)間孕婦；（5）孕婦及家屬對(duì)介入性產(chǎn)前診斷存在一定恐懼，在知情同意狀況下，可實(shí)施NIPT[15]。

3.2 NIPT 應(yīng)用及問(wèn)題近年來(lái)，NIPT 已在臨床得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)可有效規(guī)避孕婦，因侵入性產(chǎn)前診斷，而增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可強(qiáng)化胎兒染色體非整倍體疾病的檢出率，規(guī)避佳陽(yáng)性率。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，傳統(tǒng)血清學(xué)篩查檢出率為60%—70%，具有較高的漏檢率，且伴有5%假陽(yáng)性率[16]。另研究證實(shí)，NIPT 對(duì)21、18、13－ 三體綜合征檢測(cè)的準(zhǔn)確率分別可達(dá)到99.4%、97.4%以及92.5%，而假陽(yáng)性率分別為0.2%、0.5%以及0.8%。NIPT 對(duì)21 三體、18 三體與13 三體綜合征，均具備較高準(zhǔn)確率，且伴有假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)，已被歸納為臨床產(chǎn)前篩查的首選，有效彌補(bǔ)血清篩查的不足[17]。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，由于該技術(shù)的發(fā)展的限制，使其檢測(cè)結(jié)果尚無(wú)定位金標(biāo)準(zhǔn)，仍無(wú)法替代有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)[18]。而NIPT 檢測(cè)性染色體非整倍體敏感度及特異性較21、18 以及13 一三體綜合征低，導(dǎo)致該類檢測(cè)差異原因具有多類，如（1）測(cè)序自身因素，受到X 染色體GC 堿基含量便移，加之X 和Y 染色體記序列較為一致。（2）限制性胎盤嵌合以及胎兒嵌合，進(jìn)而對(duì)胎兒染色體DNA 真實(shí)狀況掩蓋[19]。故上述因素，可對(duì)胎兒性染色體非整倍提示異常孕婦，后續(xù)需實(shí)施有創(chuàng)的羊水染色體核型分析，以規(guī)避染色體非整倍體假陽(yáng)性的出現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)[20]。

4 小結(jié)

隨著NIPT 技術(shù)已在臨床得到逐步普及，NIPT 臨床應(yīng)用技術(shù)規(guī)范的出臺(tái)，使其經(jīng)驗(yàn)得到進(jìn)一步積累，NIPT 能夠有效減少出生缺陷兒，規(guī)避侵入性產(chǎn)前診斷而誘發(fā)的不良風(fēng)險(xiǎn)。我們相信，NIPT 技術(shù)能夠在我國(guó)產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷中起到關(guān)鍵作用，且具有廣闊臨床使用前景及價(jià)值。