單 萌，周 婀，馬 瑜

（1.上海康識(shí)食品科技有限公司，上海 201101；2.陜西省微生物研究所，陜西西安 710043）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），屬假單胞菌屬，廣泛分布于水、土壤、空氣、植物、污水、醫(yī)院、動(dòng)物及人體內(nèi)等各類環(huán)境中，是一種常見的水源性和食源性條件致病菌[1-3]。該菌可引起機(jī)體組織器官病變甚至壞死，進(jìn)而引起腸胃炎、敗血癥等病癥及不同程度的人畜共患性傳染病；同時(shí)，其產(chǎn)生的多種致病因子容易引起免疫力低下及受抑制人群或長(zhǎng)期使用抗生素人群的化膿性感染和耐藥性問(wèn)題[4-5]。此外，銅綠假單胞菌形成生物膜后，對(duì)干燥、紫外線、消毒劑等理化因素及不良環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力；且由該菌污染引起的產(chǎn)品腐敗會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。因此，實(shí)現(xiàn)銅綠假單胞菌準(zhǔn)確、快速檢測(cè)一直是食品加工業(yè)的關(guān)注重點(diǎn)和迫切需求[6]。

利用培養(yǎng)基對(duì)微生物菌群中特定微生物具有選擇性的這一特征，可以通過(guò)不同的選擇性培養(yǎng)基從環(huán)境中對(duì)微生物進(jìn)行分離。而關(guān)于銅綠假單胞菌的檢測(cè)主要依賴于培養(yǎng)方法，其中最為關(guān)鍵的是選擇合適的培養(yǎng)基。目前，已有多種選擇性培養(yǎng)基，如抗生素篩選培養(yǎng)基[7]、色素篩選培養(yǎng)基[8]及乙酰胺培養(yǎng)基[9]可用于假單胞菌的分離篩選。我國(guó)關(guān)于銅綠假單胞菌的檢測(cè)大多依據(jù)GB 7918.4—1987[10]和GB 8538—2016[11]，此外，國(guó)標(biāo)GB 19298—2014中明確規(guī)定各類抽檢水樣品中均不得檢出銅綠假單胞菌[12]。但上述標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法主要依賴于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及生化鑒定等檢測(cè)手段，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)程煩瑣、且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，不利于企業(yè)快速判斷結(jié)果，進(jìn)而造成檢測(cè)結(jié)果滯后。因此，實(shí)現(xiàn)銅綠假單胞菌的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)具有重要意義。

隨著人們生活水平和對(duì)健康意識(shí)的不斷提高，包裝飲用水成為了許多家庭和集體飲用水的首選。近年來(lái)，隨著包裝飲用水的消費(fèi)數(shù)量的不斷上升、產(chǎn)品種類及包裝方式的多元化，包裝飲用水中檢出銅綠假單胞菌的報(bào)道逐漸增多，原有的傳統(tǒng)檢測(cè)方法已難以滿足當(dāng)前的生產(chǎn)需求[13]。本研究同時(shí)對(duì)用于銅綠假單胞菌檢測(cè)的4種不同培養(yǎng)基的篩選效力及選擇性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，進(jìn)而通過(guò)將選擇性培養(yǎng)基鑒定結(jié)果與VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDITOF-MS）結(jié)合，對(duì)不同檢測(cè)技術(shù)、方法的有效性、適用性及相互之間的融合性進(jìn)行了比較和分析，以期提升銅綠假單胞菌的檢測(cè)效率及準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)菌株共5株，包括：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853（N-1）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922（N-2）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）ATCC13525（N-3）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltrophilia）ATCC51331（N-4）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingobacterium）ATCC31555（N-5），為廣東微生物菌種保藏中心保藏菌種。其中，銅綠假單胞菌N-1（P. aeruginosa）ATCC27853作為陽(yáng)性對(duì)照，其余菌株為陰性對(duì)照。G-1（銅綠假單胞菌，P.aeruginosa）、G-2（銅綠假單胞菌，P.aeruginosa）、G-3(銅綠假單胞菌，P.aeruginosa）、G-4（惡臭假單胞菌，Pseudomonas putida）、G-5（少動(dòng)鞘氨醇單胞菌，Sphingomonas paucimobilis）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，乙酰胺實(shí)驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性。其中，G-1、G-2、G-3分離自水源水，G-4、G-5分離自產(chǎn)品水。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基/PCA瓊脂、乙酰胺培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；RAPID’P.aeruginosa Agar（BIO-RAD）。

VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（梅里埃）；基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時(shí)間質(zhì)普（MALDI-TOF MS Biotyper System）（布魯克）；1～ 1000 μL 移液器（Eppendorf）；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）；VORTEX-6渦旋振蕩儀（其林貝爾）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將-80 ℃保存的5株標(biāo)準(zhǔn)菌株與5株實(shí)驗(yàn)室保存菌株劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，于36 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代2次，得到活化菌株[14]。

1.2.2 不同選擇培養(yǎng)基特異性比較

（1）特異性比較。將10株菌株分別劃線接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、CN瓊脂、乙酰胺培養(yǎng)基、RAPID’s P.aeruginosa Agar4種培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)24 h，比較4種培養(yǎng)基對(duì)試驗(yàn)菌株的特異性。

（2）適用性比較。將10株菌株制成不同濃度（10-2～10-6CFU）的菌懸液，按照GB 8538—2016的方法對(duì)水樣進(jìn)行過(guò)濾，將濾膜轉(zhuǎn)至營(yíng)養(yǎng)瓊脂、CN瓊脂、乙酰胺培養(yǎng)基、RAPID’s P.aeruginosa Agar4種培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察比較對(duì)試驗(yàn)菌株在4種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況及顯色反應(yīng)。

1.2.3 人工模擬污染試驗(yàn)

如表1所示，將2～4種菌混合，制備成10-1CFU的混合菌懸液，梯度稀釋至10-5CFU，取0.2 mL菌液加入250 mL模擬水樣中，按照GB 8538—2016的方法對(duì)水樣進(jìn)行過(guò)濾，將濾膜轉(zhuǎn)至乙酰胺培養(yǎng)基及RAPID’s P.aeruginosa Agar，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察、比較兩種培養(yǎng)基的檢驗(yàn)效果。

表1 人工模擬污染試驗(yàn)菌株組合

1.2.4 VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定方法

將活化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)及染色結(jié)果，根據(jù)染色結(jié)果和菌體形態(tài)選擇相應(yīng)的鑒定卡。用一次性接種環(huán)挑取待測(cè)菌株單菌落至含3 mL 0.45% NaCl溶液的一次性懸浮試管中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛戎?.5～0.6左右，填充對(duì)應(yīng)鑒定卡，采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。

1.2.5 基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS Biotyper System）鑒定方法

根據(jù)MALDI-TOF MS Biotyper System操作規(guī)程，用一次性接種環(huán)挑取新鮮待測(cè)菌株單菌落涂布于MALDI靶板，滴加1 μL濃度為70%的甲酸溶液，室溫下晾干，覆蓋1 μL基質(zhì)液，室溫下自然晾干后上機(jī)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

MALDI-TOF鑒定結(jié)果用Biotyper 3.1 database分析；其余結(jié)果采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同選擇培養(yǎng)基特異性比較

2.1.1 特異性比較

10株菌株在4種培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后的生長(zhǎng)狀況如表2所示。由表2可知，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、CN瓊脂及乙酰胺瓊脂培養(yǎng)基上，銅綠假單胞菌菌落無(wú)法與其他的假單胞菌和大腸菌群區(qū)分開來(lái)；在RAPID’s P.aeruginosa Agar上，銅綠假單胞菌呈現(xiàn)藍(lán)綠色，其他菌種在該培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或菌落顏色呈白色或淡黃色，可有效、快速的區(qū)分銅綠假單胞菌與其他菌群。

表2 試驗(yàn)菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特異性比較

2.1.2 適用性比較

由表3可知，通過(guò)不同菌濃度的試驗(yàn)可知，膜片上高濃度銅綠假單胞菌可能會(huì)使乙酰胺培養(yǎng)基呈玫紅色，低濃度銅綠假單胞菌不一定會(huì)使培養(yǎng)基呈玫紅色；標(biāo)準(zhǔn)菌株顯色效果要優(yōu)于從水源水中檢出銅綠假單胞菌；此外，惡臭假單胞菌可使乙酰胺培養(yǎng)基變色呈玫紅色。因此，實(shí)際操作中在乙酰胺培養(yǎng)基上無(wú)法直接有效區(qū)分銅綠假單胞菌與其他的菌落。不同菌濃度樣品的濾膜在RAPID’s P.aeruginosa Agar上表現(xiàn)一致，銅綠假單胞菌呈藍(lán)綠色，其他菌種在該培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或菌落顏色呈白色或淡黃色。因此，如使用濾膜法進(jìn)行銅綠假單胞菌的檢測(cè)，若使用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，有可能會(huì)造成結(jié)果假陰性或假陽(yáng)性的出現(xiàn)。而在RAPID’s P.aeruginosa Agar上的試驗(yàn)，濾膜法與直接劃線法結(jié)果一致。

表3 兩種選擇性培養(yǎng)基篩選效果的適用性比較

2.2 人工模擬污染試驗(yàn)分析

RAPID’s P.aeruginosa Agar上，銅綠假單胞菌呈藍(lán)綠色，干擾菌不生長(zhǎng)或呈白色，其他菌不會(huì)干擾其在膜片上的生長(zhǎng)；而乙酰胺培養(yǎng)基上不能分辨出銅綠假單胞菌與其他菌落。

2.3 VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

所有菌株均為革蘭氏陰性菌株，VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果見表4。VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)5株標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定結(jié)果符合率為100%，其余5株保存菌株中G-1（99%）、G-2（98%）、G-3（99%）鑒定為銅綠假單胞菌。10株菌株中陽(yáng)性菌株為4株，陰性菌株為6株，4株銅綠假單胞菌全部被檢出。

2.4 基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時(shí)間質(zhì)普（MALDITOF MS）鑒定結(jié)果

10株菌經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定得到的結(jié)果與VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定所得鑒定結(jié)果一致，如表4所示。

表4 試驗(yàn)菌株鑒定結(jié)果

2.5 銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法的優(yōu)化及驗(yàn)證

結(jié)合人工模擬污染試驗(yàn)與兩種不同鑒定系統(tǒng)的檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，如圖1所示。優(yōu)化后的檢驗(yàn)程序主要分為兩部分：①參考GB 8538—2016的方法對(duì)水樣進(jìn)行過(guò)濾，將濾膜轉(zhuǎn)至RAPID’s P.aeruginosa Agar培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)22～30 h；②利用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)RAPID’s P.aeruginosa Agar平板上典型藍(lán)綠色菌落進(jìn)行鑒定。以檢驗(yàn)程序兩部分的結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)，判定為銅綠假單胞菌，其余結(jié)果為陰性。

圖1 優(yōu)化后的銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序

采用優(yōu)化后的方法對(duì)1.2.3中的人工模擬污染試驗(yàn)水樣進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。優(yōu)化后的方法在快速識(shí)別銅綠假單胞菌與其他干擾菌（呈白色）的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了疑似菌落的快速鑒定。所得鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)鑒定方法一致。

圖2 銅綠假單胞菌檢出情況及其在不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況比較

3 結(jié)論與討論

銅綠假單胞菌作為一類致病性較低但耐藥性強(qiáng)的細(xì)菌，可以長(zhǎng)期在水環(huán)境中生存，是水質(zhì)監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一。隨著銅綠假單胞菌污染飲用水及耐藥性等問(wèn)題的逐漸突出，選擇適合生產(chǎn)企業(yè)的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的快速檢測(cè)方法，已成為當(dāng)前產(chǎn)業(yè)界和保障人們食品安全的迫切需求?，F(xiàn)有國(guó)標(biāo)中使用的傳統(tǒng)方法涉及濾膜過(guò)濾、微生物培養(yǎng)觀察鑒別及驗(yàn)證、氧化酶試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)等，由于試驗(yàn)過(guò)程操作煩瑣、工作量大、成本高且耗時(shí)長(zhǎng)，已難以滿足當(dāng)前食品安全生產(chǎn)的需求。而針對(duì)假單胞菌的選擇性的開發(fā)是一個(gè)長(zhǎng)期的挑戰(zhàn)。此外，不同檢測(cè)技術(shù)（或方法）的有效性、適用性及相互之間的融合性也成為了提升檢測(cè)效率和質(zhì)量的關(guān)鍵。隨著微生物快速檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）已被廣泛用于常規(guī)試驗(yàn)微生物，特別是銅綠假單胞菌的檢測(cè)與鑒定[15-17]。

為快速、有效地區(qū)分銅綠假單胞菌與其他干擾菌，本研究通過(guò)對(duì)不同選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，乙酰胺瓊脂上銅綠假單胞菌的特異性較差，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，而銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基（RAPID’s P.aeruginosa Agar）憑借其典型的菌落特征以及較短的增菌時(shí)間，適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行快速判定。VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及其所攜帶的分析系統(tǒng)可在快速完成菌種鑒定的同時(shí)對(duì)獲得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，操作過(guò)程安全、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好[18-19]。目前，該系統(tǒng)已被應(yīng)用于中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于沙門氏菌、單增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的檢驗(yàn)過(guò)程中[20-22]。但是，在日常檢驗(yàn)工作中按照GB 8538—2016方法和GB 7918.4—1987方法檢測(cè)得到的部分陽(yáng)性菌株在采用VITEK 2 Compact系統(tǒng)進(jìn)行鑒定時(shí)會(huì)有一定概率呈現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，從而會(huì)對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中的水質(zhì)鑒定結(jié)論產(chǎn)生誤導(dǎo)。推測(cè)其原因在于部分樣品中的陽(yáng)性菌株在培養(yǎng)過(guò)程中因其細(xì)胞代謝產(chǎn)物理化性質(zhì)的差異導(dǎo)致了VITEK 2 Compact系統(tǒng)中個(gè)別生化顯色反應(yīng)的變化從而導(dǎo)致系統(tǒng)的誤判。因此，在采用VITEK 2 Compact系統(tǒng)進(jìn)行鑒定時(shí)，使用快速有效的特異性顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照以減少假陽(yáng)性或假陰性誤差是十分必要的。

此外，基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時(shí)間質(zhì)普（MALDI-TOF MS）因其對(duì)致病菌識(shí)別速度快等優(yōu)勢(shì)也在微生物檢測(cè)領(lǐng)域得到了推廣應(yīng)用。崔學(xué)文等[23]應(yīng)用MALDI TOF MS對(duì)不同來(lái)源的15株銅綠假單胞菌及8株干擾菌進(jìn)行鑒定，所得鑒定結(jié)果于VITEK完全一致。李進(jìn)等[24]利用MALDI TOF MS對(duì)VIM型和SPM型金屬酶銅綠假單胞菌進(jìn)行檢測(cè)分析，MALDI-TOF MS對(duì)25株VIM型菌株靈敏度為92.0%，對(duì)于20株SPM型菌株靈敏度為80.0%，所得結(jié)果比常規(guī)PCR技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)。但是，由于MALDI-TOF MS具有極高的靈敏度，為避免試驗(yàn)誤差影響，對(duì)于試驗(yàn)所用的耗材、標(biāo)準(zhǔn)溶劑以及試驗(yàn)器具的質(zhì)量要求較高。同時(shí)，由于該檢測(cè)需要涉及使用專業(yè)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)所得質(zhì)量圖譜與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定和各種數(shù)據(jù)的聚類分析，因此對(duì)于檢測(cè)人員的技術(shù)和業(yè)務(wù)素養(yǎng)要求也較高。再加之整套系統(tǒng)的設(shè)備成本，使得該方法目前還難以在廣大的中小企業(yè)中得以普及應(yīng)用。

因此，銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基（RAPID’s P.aeruginosa Agar）憑借其典型的菌落特征以及較短的增菌時(shí)間，將該培養(yǎng)基與VITEK 2 Compact系統(tǒng)結(jié)合使用可有效提高檢測(cè)效率、準(zhǔn)確率、特異性及時(shí)效性，適用于對(duì)大批量樣品進(jìn)行快速判定。但考慮到本研究所采用的試驗(yàn)檢測(cè)樣本來(lái)源和數(shù)量的局限性，這一方法還需通過(guò)后續(xù)對(duì)大量實(shí)際樣本的檢測(cè)應(yīng)用來(lái)積累數(shù)據(jù)，以期為我國(guó)的飲用水安全保障事業(yè)提供技術(shù)支持。