于金英，王 津，全奕潔，汪 冶

（麗水學(xué)院，浙江麗水 323000）

蓮房（蓮蓬）是蓮的成熟花托，是蓮子收獲過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，一般在蓮子采收過(guò)程中被丟棄。蓮房與葡萄籽相似，含有大量原花青素成分，原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素或兒茶素單體及其聚合體形成的多酚化合物組成的，按照聚合度的不同以及單體的構(gòu)象或鍵合位置的不同可形成多種化合物，一般分為低聚體OPC（聚合度n=2～4）和高聚體PPC（聚合度n≥5）。聚合體的抗氧化能力隨著聚合度的增大而降低，且低聚體（OPC）較高聚體（PPC）具有良好的生物利用度[1]。為了有效利用蓮房原花青素（Procyanidins Of Lotus Seedpod，LSPC），本研究利用層次分析法（The Analytic Hierarchy Process，簡(jiǎn)稱(chēng)AHP法）開(kāi)展多指標(biāo)優(yōu)選的綜合評(píng)價(jià)，通過(guò)對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)：蓮房原花青素（LSPC）提取率、低聚蓮房原花青素（LSOPC）提取率、高聚蓮房原花青素（LSPPC）提取率進(jìn)行綜合評(píng)估，可以更加客觀(guān)地反映處州白蓮蓮房中蓮原花青素（LSPC）的提取效率和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

處州白蓮蓬購(gòu)于麗水市蓮都區(qū)老竹鎮(zhèn)處州白蓮種植基地，剝除蓮子，將蓮蓬自然陰干。

1.2 儀器與試劑

SG250H超聲波提取器、HX-5FD真空冷凍干燥設(shè)備。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）、硫酸、香草醛、甲醇、乙醇。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蓮房原花青素提取

選用陰干的去除蓮子的干燥蓮房若干，用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)24目篩，稱(chēng)取適量粉末，加入一定量的乙醇，超聲提取，離心過(guò)濾得到提取液。提取液經(jīng)過(guò)薄層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收酒精后，剩余水溶液進(jìn)行冷凍干燥處理制備蓮房原花青素（LSPC）樣品。

1.3.2 低聚蓮房原花青素（LSOPC）和高聚蓮房原花青素（LSPPC）樣品制備

利用蓮房原花青素中低聚體和高聚體溶解性差異進(jìn)行分級(jí)分離。將上述制備的蓮房原花青素樣品溶于水，首先采用等體積乙酸乙酯萃取3次富集低聚蓮房原花青素，回收溶劑制備低聚蓮房原花青素（LSOPC）樣品，萃取后的水溶液經(jīng)冷凍干燥制備高聚蓮房原花青素（LSPPC）樣品。

1.3.3 蓮房原花青素含量的測(cè)定

（1）兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。準(zhǔn)確稱(chēng)取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用70%乙醇溶解并定容至25 mL，配制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mg/mL。分別移取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL至25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容，制備得到 濃 度 為 0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL和0.20 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別移取上述不同濃度的溶液0.5 mL置于10 mL比色管中，然后依次加入2.5 mL的30 g/L香草醛-甲醇溶液和2.5 mL的30%硫酸-甲醇溶液，在30 ℃水浴里避光反應(yīng)15 min，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光值，以?xún)翰杷貪舛葹闄M坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[2]。

（2）蓮房原花青素提取率的計(jì)算。取1.3.1和1.3.2項(xiàng)制備的樣品，按照（1）項(xiàng)操作。用70%乙醇作為待測(cè)液，在相同條件下，作一組空白對(duì)照試驗(yàn)。利用兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程計(jì)算提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，然后計(jì)算蓮房原花青素的提取率。

式中：n為提取液稀釋倍數(shù)；c為提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為蓮房樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和提取次數(shù)（D）4個(gè)因素，以L(fǎng)SPC提取率（X）、LSOPC提取率（Y）、LSPPC提取率（Z）為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

原花青素結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，易溶于水、甲醇、乙醇和稀酸等極性溶劑中[3-4]，因此選擇酒精溶液作為蓮房原花青素的提取劑，采用超聲波輔助進(jìn)行提取，以L(fǎng)SPC提取率（X）、LSOPC提取率（Y）、LSPPC提取率（Z）為考察指標(biāo)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%和80%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30）、提取時(shí)間（10 min、15 min、20 min、25 min和30 min）、提取次數(shù)（1次、2次、3次、4次和5次）等因素對(duì)蓮房原花青素提取效果的影響。按照1.3.1和1.3.2項(xiàng)制備樣品，然后按照（1）項(xiàng)操作，最后按照1.3.3中（2）分別計(jì)算提取率。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定提取工藝影響因素水平。選用乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和提取次數(shù)（D）4個(gè)因素，以L(fǎng)SPC提取率%（X）、LSOPC提取率%（Y）、LSPPC提取率%（Z）為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。按照多指標(biāo)權(quán)重分析進(jìn)行綜合總評(píng)分，并進(jìn)行直觀(guān)分析與方差分析。

1.4 AHP法確定指標(biāo)權(quán)重

1.4.1 建立優(yōu)先矩陣

為了優(yōu)化蓮房原花青素的抗氧化活性部位提取工藝，將LSPC提取率（%）、LSOPC提取率（%）、LSPPC提取率（%）作為權(quán)重指標(biāo)予以量化，即將3個(gè)指標(biāo)分為3個(gè)層次，并確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)椋篖SOPC提取率%（Y）＞LSPC提取率%（X）＞LSPPC提取率%（Z），構(gòu)建成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣，同時(shí)賦予各指標(biāo)相對(duì)評(píng)分，見(jiàn)表1。

表1 指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣

1.4.2 歸一化權(quán)重系數(shù)

1.4.3 一致性比率

CR=CI/RI，作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標(biāo)，經(jīng)計(jì)算一致性比例因子CR=0.008 9，CR＜0.10即指標(biāo)比較的優(yōu)先判斷矩陣具有滿(mǎn)意的一致性，所得權(quán)重系數(shù)有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用1.3.1的方法，繪制出兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 蓮房原花青素提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同因素對(duì)蓮房原花青素（LSPC）提取的影響

以蓮房原花青素（LSPC）的提取率（%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)方法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、料液比（g/mL）、提取時(shí)間（min）、提取次數(shù)（次）4個(gè)不同因素對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，得到結(jié)果如圖2所示。研究結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%，料液比1∶20，提取時(shí)間25 min時(shí)蓮房原花青素（LSPC）的提取率較高，提取次數(shù)（3次和4次）差別不明顯，從實(shí)際操作角度考慮，選擇采用提取4次作為單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果。

圖2 不同因素對(duì)LSPC提取率的影響

2.2.2 不同因素對(duì)蓮房原花青素（LSOPC）提取的影響

以蓮房原花青素（LSOPC）的提取率（%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)方法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、料液比（g/mL）、提取時(shí)間（min）、提取次數(shù)（次）4個(gè)不同因素對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，得到結(jié)果如圖3所示。研究結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%，料液比1∶20，提取時(shí)間20 min時(shí)蓮房原花青素（LSOPC）的提取率較高，提取次數(shù)（3次、4次、5次）差別不明顯，從實(shí)際操作角度考慮，選擇采用提取4次作為單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果。

圖3 不同因素對(duì)LSOPC提取率的影響

2.2.3 不同因素對(duì)蓮房原花青素（LSPPC）提取的影響

以蓮房原花青素（LSPPC）的提取率（%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)方法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、料液比（g/mL）、提取時(shí)間（min）、提取次數(shù)/（次）4個(gè)不同因素對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，得到結(jié)果如圖4所示。研究結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%，料液比1∶15，提取時(shí)間20 min，提取3次時(shí)蓮房原花青素（LSPPC）的提取率較高。

圖4 不同因素對(duì)LSPPC 提取率的影響

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.2項(xiàng)的單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終確定提取工藝影響因素水平，見(jiàn)表2。

表2 L9（34）因素水平表

按照正交試驗(yàn)L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果X、Y和Z值，以1.4.2確認(rèn)的權(quán)重分別計(jì)算出9組正交試驗(yàn)綜合評(píng)分（M），總得分（M）=0.539 6Y+0.297 0X+ 0.163 4Z，結(jié)果見(jiàn)表3。

以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)表3中數(shù)據(jù)直觀(guān)分析表明（表4），優(yōu)化提取工藝為A1B2C3D2，方差分析結(jié)果（表5）顯示因素A、B、C、D對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響，最終確認(rèn)生產(chǎn)工藝為A1B2C3D2，即加入50%乙醇，料液比1∶15，超聲提取4次，每次30 min。

表3 正交試驗(yàn)分析

表4 正交試驗(yàn)直觀(guān)分析

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取蓮房樣品適量，按照優(yōu)化提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，分別測(cè)定LSPC、LSOPC和LSPPC提取率，結(jié)果見(jiàn)表6。所得工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行。

表6 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

超聲的機(jī)械作用和空化作用可以破壞細(xì)胞壁，加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)有效成分的傳遞作用，且不會(huì)改變小分子化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，可以加快細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的溶出速度[5]。因此，較一般常規(guī)溶劑加熱提取方式提取時(shí)間更短，提取效率更高。

層次分析法（The Analytic Hierarchy Process，簡(jiǎn)稱(chēng)AHP法）是一種解決多目標(biāo)的復(fù)雜問(wèn)題的定性與定量相結(jié)合的決策分析方法，判斷和衡量目標(biāo)能否實(shí)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)之間的相對(duì)重要程度，并合理地給出每個(gè)決策方案的各標(biāo)準(zhǔn)的權(quán)數(shù)，利用權(quán)數(shù)求出各方案的優(yōu)劣次序[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)綜合考慮蓮房中總原花青素（LSPC）、低聚蓮房原花青素（LSOPC）、高聚蓮房原花青素（LSPPC）提取率，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為考察因素，采用層次分析法、多指標(biāo)加權(quán)綜合分析法，利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選原花青素的提取效率。優(yōu)化后的工藝具有良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和可操作性。