侯衛(wèi) 汪宗清 陳晨 湯小虎

摘要：目的 探討甘草附子湯治療強直性脊柱炎（AS）的作用機制。方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘甘草附子湯中的甘草、附子、桂枝、白術(shù)的化學(xué)成分、作用靶點，運用Uniprot數(shù)據(jù)庫將其其標準化，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得AS相關(guān)基因，并繪制甘草附子湯活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，在蛋白互作數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建靶蛋白網(wǎng)絡(luò)圖并選取核心靶點，對此進行基因本體（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果 甘草附子湯治療AS的關(guān)鍵成分有槲皮素、山柰酚、柚皮素等，關(guān)鍵靶點為腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長因子、絲裂原活化蛋白激酶3、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2等，GO功能富集分析示生物學(xué)過程1387條，分子功能80條，細胞組成29條，KEGG通路富集分析涉及IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等排名較前。結(jié)論 甘草附子湯通過多成分、多靶點和多途徑治療AS，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用，為進一步機制研究提供一定的方向及參考。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);甘草附子湯;強直性脊柱炎;免疫調(diào)節(jié);炎癥反應(yīng)

中圖分類號：R684.3 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）11-0049-07

Study on the Mechanism of Licorice and Monkshood Decoction in the Treatmentof Ankylosing Spondylitis Based on Network Pharmacology

HOU Wei1， WANG Zong-qing1， CHEN Chen1， TANG Xiaohu1，2

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Licorice and Monkshood Decoction in the treatment of ankylosing spondylitis （AS） patients. Methods： TCMSP database was used to excavate the chemical constituents and targets of liquorice， monkshood， cassia twig and atractylodes in Licorice and Monkshood Decoction and Uniprot database used to standardize them. And then AS-related genes were obtained from GeneCards database and the map of the active ingredients of Licorice and Monkshood Decoction-effect Targets-disease network was drawn to construct the target protein network diagram in the protein interaction database and select the core targets and make gene ontology （GO） function and genome encyclopedia （KEGG） access enrichment analysis. Results： The key components of Licorice and Monkshood Decoction in the treatment of AS patients were quercetin， kaempferol， naringenin， and etc. The key targets were tumor necrosis factor， vascular endothelial growth factor， mitogen-activated protein kinase 3， prostaglandin endoperoxidation biosynthase 2， and etc.. The GO function enrichment analysis showed 1387 biological processes， 80 molecular functions， and 29 cell composition. The KEGG access enrichment analysis involved IL-17 signaling pathway， AGE-RAGE signaling pathway and tumor necrosis factor signaling pathway. Conclusion： Licorice and Monkshood Decoction can treat AS patients through multiple components， multiple targets and multiple pathways， and play role in the anti-inflammation response， analgesia and immune regulation， which provides certain directions and references for further mechanism research.

【Key words】Internet pharmacology; Licorice and Monkshood Decoction; Ankylosing Spondylitis; Immune Regulation; Inflammatory Response

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種全身性免疫性疾病。本病多從骶髂關(guān)節(jié)起病，主要涉累及中軸關(guān)節(jié)，中晚期可延及其它關(guān)節(jié)，嚴重者可致脊柱強直和功能喪失[1]。其病因處于研究探索中，研究發(fā)現(xiàn)，感染、環(huán)境、遺傳、免疫等因素可能為致病因素[2]。目前尚缺乏病因治療藥物，臨床主要采用非甾體抗炎藥、免疫抑制劑及生物制劑等，長期使用易產(chǎn)生的毒副作用，以至于患者依從性差[3]。生物制劑雖然效果較好，但長期應(yīng)用經(jīng)濟負擔較重，使其選擇仍較為受限。中醫(yī)學(xué)將強直性脊柱炎歸屬為“痹證、大僂”等范疇，認為其本在腎陽虛衰、肝腎不足，風(fēng)寒濕熱、瘀血痰濁為標，病性多為虛實夾雜[4]。

甘草附子湯源自張仲景《傷寒論》，“風(fēng)濕相搏，掣痛不得伸，近之則痛劇……甘草附子湯主之 ?！庇筛什荨仔g(shù)、附子、桂枝4味中藥組成，凡屬風(fēng)寒濕邪互結(jié)于肢體之證，療效頗佳。甘草附子湯在強直性脊柱炎治療中臨床中效果良好[5-6]，具體機制尚未完全明確。鄧偉[7]研究發(fā)現(xiàn)甘草附子湯能防止破骨細胞形成，降低降低RANKL/OPG mRNA比值和M-CSF mRNA水平，減少骨侵蝕和骨破壞;高彩霞等[8]研究表明選用甘草附子湯方治療AS活動期，有助有改善炎癥指標及疼痛癥狀，且安全性更佳。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方面探討甘草附子湯治療AS的作用機制。

1 資料與方法

1.1 甘草附子湯的化學(xué)成分 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分別檢索甘草附子湯中甘草、附子、白術(shù)、桂枝所有化學(xué)成分，檢索條件“口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18”，得到有效成分與作用靶點，并對靶點以Uniport數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）進行標準化，得到蛋白質(zhì)ID。

1.2 AS相關(guān)靶點的獲取及與甘草附子湯靶點的映射 以“ankylosing spondylitis”為檢索詞，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）獲取AS的靶點，將甘草附子湯靶基因與AS相關(guān)基因取交集，得到共同靶基因。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將甘草附子湯的活性成分、共同靶基因數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 軟件，構(gòu)建甘草附子湯-化學(xué)成分-靶點-強直性脊柱炎的網(wǎng)絡(luò)圖，依據(jù)活性成分Dergee值篩選核心成分。

1.4 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點的分析 將共同靶基因錄入STRING數(shù)據(jù)庫，以“Homo Sapience”為物種，繪制蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖和導(dǎo)出TSV文件，并且運用R軟件繪制條形圖。

1.5 基因本體（GO）功能與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 關(guān)鍵靶基因GO富集分析可得到生物過程、分子功能和細胞組分3部分;KEGG通路富集分析，得到甘草附子湯作用于AS的主要通路，并對數(shù)據(jù)進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 甘草附子湯活性化合物及潛在靶點 通過篩選條件，基于TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索得到共127個活性成分。運用Uniprot數(shù)據(jù)庫對活性成分靶點進行標準化，共得到213個化合物相關(guān)潛在靶點。

2.2 強直性脊柱炎相關(guān)基因 共得到AS相關(guān)基因共2124個，人類白細胞抗原組織相容復(fù)合物B（HLA-B）、腫瘤壞死因子（TNF）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶 1（ERAP1）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細胞介素23受體（IL23R）評分較高，共有71個交集基因。

將96個活性成分及71個共有靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1，圖中紫色為疾病，綠色為中藥，藍色為化合物，黃色為靶點，并對該網(wǎng)絡(luò)中的活性成分所對應(yīng)的靶點數(shù)目進行分析，數(shù)值越大表示在治療AS的過程中所發(fā)揮的作用也越大，可得到槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、甘草查爾酮A（licochalcone a）評分為前5，分別為50、17、15、14、13個關(guān)鍵靶點連接，其中對AS具有重要的意義，見表1（度值>10）。

2.4 核心靶點互作圖 運用STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建71個共同靶基因的蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，并簡略1個游離靶點，見圖2。圖中有70個靶蛋白，897條靶蛋白相互作用關(guān)系，平均節(jié)點數(shù)為25.3;利用R軟件繪制條形圖，展degree排名前30的靶點，見圖3。圖中條形柱的長度代表degree的大小，由圖可見腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、CXC趨化因子配體8（CXCL8）、白細胞介素-1（IL1B）、信號轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、上表皮生長因素（EGF）、原癌基因c-fos（FOS）等基因排名靠前，度值越大，意味在強直性脊柱炎的治療中發(fā)揮的作用也越大。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析顯示，共有生物學(xué)過程1387條，脂多糖應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、對細菌來源的分子反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)（regulation of inflammatory response）等排名較前;分子功能80條，細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）排名較前;細胞組成29條，細胞組分中膜微區(qū)（membrane microdomain）、細胞膜膜筏（membrane raft）、膜區(qū)（membrane region）比例最大。見圖4～6。

KEGG分析得出有與AS相關(guān)的144條信號通路。據(jù)富集基因數(shù)目選取排名前20的通路，IL-17 signaling pathway、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、TNF signaling pathway排名較前，主要涉及炎癥反應(yīng)、血管細胞凋亡與免疫調(diào)節(jié)等多個環(huán)節(jié)，圖中，顏色越紅代表富集程度越高，見圖7。

3 討論

強直性脊柱炎屬于慢性進行性炎性疾病，需長期規(guī)律用藥，尚無治愈的藥物及方法。祖國醫(yī)學(xué)在強直性脊柱炎診治歷史悠久，臨床效果好，毒副作用較少。甘草附子湯由附子、甘草、白術(shù)、桂枝4味藥物組成，甘草益氣、緩解止痛，附子散寒除濕止痛，桂枝溫經(jīng)通絡(luò)止痛，白術(shù)健脾除濕，共奏溫經(jīng)助陽，祛風(fēng)除濕之效?，F(xiàn)代藥理研究也表明，甘草附子湯有減低炎癥水平、鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫等作用[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)甘草附子湯中槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草查爾酮A等是治療AS的主要成分。槲皮素最核心作用之一是調(diào)節(jié)炎癥，可以抑制炎癥細抗胞因子和炎癥酶，如降低IL-6、IL-1、IL-10的表達量，而進行抗炎癥作用[10];山柰酚能顯著抑制MAPK通路的表達，降低MDC、IP-10等炎癥因子的形成，從而有效抑制炎癥的產(chǎn)生[11]。柚皮素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物活性，牛新力等[12]研發(fā)現(xiàn)其可阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常規(guī)樹突狀細胞的趨化性和抗原呈遞功能，減少脾臟T細胞分泌的L-17和IL-6，可能成為自身免疫性疾病研究新方向?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草查爾酮A有抗炎、抗氧化、免疫促進等作用，能促進MAPK通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化進抑制MA7A細胞增殖，抗關(guān)節(jié)炎作用主要依靠促進MA7A細胞及機制腫瘤細胞的表達[13]。

通過對交集基因進行PPI互作分析發(fā)現(xiàn)，TNF、VEGFA、MAPK3、PTGS2、CXCL8、IL1B、STAT3、EGF等為關(guān)鍵基因。TNF主要能促進AS患者TNF-α水平升高，放達免疫炎癥反應(yīng)，抑制促生長因子，成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等的作用，減少成骨細胞分，促進破骨細胞的形成;TNF-α加快關(guān)節(jié)炎損害，主要通過促進軟骨細胞分泌纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白原[14]。VEGFA能參與血管新生，主要通過刺激血管內(nèi)皮細胞分裂增殖。有研究表明，其作為促血管形成因子，能夠參與免疫調(diào)節(jié)，與AS患者的炎癥指標、疾病活動等呈正相關(guān)[15]。 MAPK3為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，在基因表達調(diào)控及細胞功能活動中發(fā)揮重要作用，可被細胞外的信號、物理刺激、炎性細胞因子（如IL1B和IL18）、腫瘤生長因子激活[16]。PTGS2與各種炎性毛細血管后微靜脈通透性、白細胞的趨化、產(chǎn)生T細胞及疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，有抗炎和抗氧化的作用[17]。CXCL8涉及淋巴細胞活化、增殖等，白細胞遷移及免疫反應(yīng)過度活化，可促使機體免疫損傷[18]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，甘草附子湯依靠IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等發(fā)揮AS的作用。白細胞介素-17（IL-17）通過IL-17信號通路在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可以激活NF-κB，誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨炎癥和破壞[19]。免疫球蛋白AGE與RAGE配體結(jié)合，可促使NF-κβ、細胞分子等激活，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)生[20]。TNF-α信號通路的傳遞對機體內(nèi)細胞的生長具有重要作用，有研究表明，AS患者病理性成骨與機體間充質(zhì)干細胞（MSCs）成骨能力的增強相關(guān)，而TNF-α可以抑制AS患者體內(nèi)MSCs成骨分化[21-22]。

綜上所述，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，甘草附子湯可以作用于多個靶點，介導(dǎo)多條通路發(fā)揮抑制炎癥、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用達到治療AS的效應(yīng)。但是后續(xù)應(yīng)進行生物學(xué)實驗及臨床驗證，以明確甘草附子湯治療AS的機制。

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（收稿日期：2021-07-29）