李雷 王峰 劉念 張長(zhǎng)城 李剛 宋曉飛 劉瑜 王華磊 趙玉果 楊國(guó)志

南陽(yáng)市中心醫(yī)院骨二科，河南 南陽(yáng) 473000

骨質(zhì)疏松癥是一種全身骨代謝疾病，絕經(jīng)后婦女骨折發(fā)生與骨質(zhì)疏松有關(guān)，單位體積骨量減少、骨組織微環(huán)境發(fā)生退化是其主要特征[1]。骨質(zhì)疏松癥骨折不僅愈合緩慢而且愈合質(zhì)量較差，畸形愈合風(fēng)險(xiǎn)較高。微小RNA(micro RNA，miRNA)是源于內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物的單鏈非編碼RNA[2]，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)37個(gè)miRNA與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的某些核心疾病存在靶向作用[3]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是人體骨髓中具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞潛能的多能干細(xì)胞[4]，其增殖能力降低會(huì)誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥，雌性激素缺乏會(huì)引起B(yǎng)MSCs生物學(xué)特性改變，加重機(jī)體骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程，但其中具體作用機(jī)制尚未完全闡明[5]。miR-21納米微局部注射可以促進(jìn)骨折愈合生物活性[6]，但在絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松性骨折有關(guān)研究報(bào)道較少。本研究旨在探討miR-21對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥小鼠BMSCs增值能力與成骨能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料、骨質(zhì)疏松癥小鼠模型構(gòu)建

將12只8周齡C57BL/6J雌性小鼠{南方醫(yī)科大學(xué)[SCXK(粵)2016-0041}參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(記為OVX組)，另選12只小鼠只切除卵巢周圍接近的脂肪組織、不摘除卵巢(記為Ctrl組)，剩余操作與OVX組一致，術(shù)后腹腔注射4×104U青霉素預(yù)防感染。所有小鼠均在SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房(溫度22 ℃～24 ℃，濕度58%～57%，人工關(guān)照12 h/d)中連續(xù)飼養(yǎng)8周，Micro-CT掃描結(jié)果明確骨質(zhì)疏松癥小鼠模型構(gòu)建成功。

1.2 BMSCs分離、培養(yǎng)及純化

模型構(gòu)建成功后，處死小鼠，α-MEM培養(yǎng)液(含10%血清)沖洗股骨、脛骨髓腔，移液器輕柔吹打均勻，800 r/min 5 min，棄上清，α-MEM培養(yǎng)液(含10%血清)重懸細(xì)胞，置于培養(yǎng)瓶在37 ℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶壁80%～90%，0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，再次傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要試劑和儀器

MTT Assay Kit(YB111105-500，Ybscience)，siPORT NeoFX 轉(zhuǎn)染劑(AM4510，美國(guó)Ambion公司)，α-MEM培養(yǎng)基(MEL07-6X500 ML，美國(guó)Caisson公司)，ant-miR-21和ant-miR-21 negative control、pre-miR-21和pre-miR-negative control(廣州銳博生物科技有限公司)，PCNA、Ki67、Runx2抗體(FNab06217、FNab09788、FNab07536，武漢菲恩生物科技有限公司)，Osterix抗體(bs-1110R-1，上海恒斐生物科技有限公司)，茜素紅(I0013，上海寶曼生物科技有限公司)，堿性磷酸酶染色試劑盒(XY-44274-1，上海信裕生物科技有限公司)，堿性磷酸酶活性試劑盒(CK-E20105，武漢益普生物科技有限公司)，miRNA提取試劑盒(ZYB1803，上海澤葉生物科技有限公司)，miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)(KR211、FP411，天根生化科技有限公司)。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma 3110，Thermo Fisher Scientific)，多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax iD3，美國(guó)Molecular Devices)，Micro-CT(80989787 日本hitachi-aloka)，7500 fast定量PCR儀器(100019，美國(guó)ABI公司)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

提取Ctrl組、OVX組BMSCs的miRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并作為PCR擴(kuò)增模板，95 ℃ 15 min、94 ℃ 20 s，60 ℃，34 s，42個(gè)循環(huán)，U6為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次。

1.5 miR-21轉(zhuǎn)染小鼠BMSCs

Ctrl組BMSCs分為2組，OVX組BMSCs分為4組，參考文獻(xiàn)[8]用siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染pre-miR-negative control(pre-miR-NC)、ant-miR-negative control(ant-miR-NC)至Ctrl組BMSCs，記為Ctrl-pre-miR-NC、Ctrl-ant-miR-NC；將pre-miR-21、pre-miR-NC、ant-miR-21、ant-miR-NC至OVX組BMSCs分別記為OVX-pre-miR-21、OVX-pre-miR-NC、OVX-ant-miR-21、OVX-ant-miR-NC，培養(yǎng)條件同1.2，培養(yǎng)48 h，進(jìn)行miR-21相對(duì)表達(dá)水平RT-PCR驗(yàn)證。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取1.5中轉(zhuǎn)染所得BMSCs，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL，接種96孔板(100 μL/孔)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，加入0.5 mg/mL MTT(100 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO(200 μL/孔)孵育0.5 h，多功能酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm檢測(cè)吸光值(A值)。重復(fù)3次。

1.7 BMSCs成骨誘導(dǎo)與茜素紅染色

取1.5中轉(zhuǎn)染所得BMSCs，生長(zhǎng)融合達(dá)>70%時(shí)，培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)2周，茜素紅染色[9]、堿性磷酸酶(ALP)染色法[10]、ELISA法檢測(cè)BMSCs成骨能力和ALP活性。茜素紅染色：誘導(dǎo)結(jié)束后，棄成骨誘導(dǎo)液，4%多聚甲醛固定0.5 h，茜素紅染色0.5 h，PBS洗滌10 min，顯微鏡觀察；茜素紅染色定量：茜素紅染色后，加入CPC溶液，充分溶解，波長(zhǎng)562 nm檢測(cè)光度值，茜素紅染色相對(duì)定量=實(shí)驗(yàn)組光度值/對(duì)照組光度值。ALP染色：細(xì)胞固定同茜素紅染色，加400 μL ALP染液，室溫避光染色1 h，清水沖洗2次，晾干，顯微鏡觀察。ALP活性按照ELISA法試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.8 Western-blotting檢測(cè)

提取1.5中BMSCs培養(yǎng)48 h細(xì)胞總蛋白，調(diào)整蛋白濃度、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、密封2 h，加入PCNA、Ki67、Runx2、Osterix、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記二抗(1∶500)孵育1 h，顯色，凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件分析條帶灰度相對(duì)值。重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism、SPSS 22.0軟件，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs中miR-21表達(dá)水平

VOX組骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs中miR-21表達(dá)水平低于Ctrl組(P<0.05)(圖1)。

圖1 骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs中miR-21表達(dá)水平Fig.1 Expression level of miR-21 in BMSCs of osteoporosis mice注：與Ctrl組比較，*P<0.05。

2.2 miR-21轉(zhuǎn)染骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs驗(yàn)證

OVX-pre-miR-21組BMSCs中miR-21相對(duì)表達(dá)水平高于OVX-pre-miR-NC組(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC組BMSCs中miR-21相對(duì)表達(dá)水平低于Ctrl-pre-miR-NC組(P<0.05)；OVX-ant-miR-21組BMSCs中miR-21相對(duì)表達(dá)水平低于OVX-ant-miR-NC組(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC組BMSCs中miR-21相對(duì)表達(dá)水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-21轉(zhuǎn)染骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs驗(yàn)證A：miR-21高表達(dá)驗(yàn)證，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；B：miR-21低表達(dá)驗(yàn)證，與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.2 Verification of BMSCs transfected with miR-21 in osteoporosis miceA: Verification of high expression of miR-21, compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; B: Verification of low expression of miR-21, *P<0.05 compared with Ctrl-ant-Mir-NC group; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

2.3 miR-21對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs增殖的影響

OVX-pre-miR-21組細(xì)胞增殖、PCNA、Ki67水平高于OVX-pre-miR-NC組與Ctrl-pre-miR-NC(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC組細(xì)胞增殖、PCNA、Ki67水平低于Ctrl-pre-miR-NC(P<0.05)；OVX-ant-miR-21組細(xì)胞增殖、PCNA、Ki67水平低于OVX-ant-miR-NC組與Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC組細(xì)胞增殖、PCNA、Ki67水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(圖3)。

圖3 miR-21對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs增殖的影響A：miR-21高表達(dá)下BMSCs細(xì)胞增殖情況(24、48、72 h)；B：miR-21低表達(dá)BMSCs細(xì)胞增殖情況(24、48、72 h)；C：miR-21高表達(dá)下BMSCs(48 h)PCNA、Ki-67凝膠成像結(jié)果；D：miR-21低表達(dá)下小鼠BMSCs(48 h)PCNA、Ki-67凝膠成像結(jié)果；E：C圖蛋白水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05，與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；F：D圖蛋白水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.3 The effect of miR-21 on the proliferation of BMSCs in osteoporosis miceA: Proliferation of BMSCs cells under high expression of miR-21 (24, 48, 72 h); B: Proliferation of BMSCs with low expression of miR-21 (24, 48 and 72 h); C: The imaging results of BMSCs (48 h) of PCNA and Ki-67 gel with highly expressed miR-21. D: The imaging results of BMSCs (48 h) of PCNA and Ki-67 gel with lowly expressed miR-21. E: Figure C statistical results of protein levels; Compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05, compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; F: Fig. D statistical results of protein level; Compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

2.4 miR-21對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs成骨能力的影響

OVX-pre-miR-21組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平高于OVX-pre-miR-NC組(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平低于Ctrl-pre-miR-NC組(P<0.05)；OVX-ant-miR-21組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平低于OVX-ant-miR-NC組與Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(圖4～6)。

圖4 各組骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs ALP染色結(jié)果A：各組骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs ALP染色(×200)，a：Ctrl-pre-miR-NC組，b：OVX-pre-miR-NC組，c：OVX- pre-miR-21組，d：Ctrl-ant-miR-NC組，e：OVX-ant-miR-NC組，f：OVX-ant-miR-21組；B：miR-21高表達(dá)下BMSCs ALP活性，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；C：miR-21低表達(dá)下BMSCs ALP活性，與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.4 ALP staining results of BMSCs in each groupA: BMSCs and ALP staining of osteoporosis mice in each group(×200), a: Ctrl-pre-Mir-NC group, B: OVX-pre-Mir-NC group, C: OVX-pre-miR-21 group, D: Ctrl-ant-Mir-NC group, e: OVX-ant-Mir-NC group, F: OVX-ant-miR-21 group; B: ALP activity of BMSCs under high expression of miR-21, *P<0.05 compared with Ctrl-pre-Mir-NC group; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; C: ALP activity of BMSCs under low expression of miR-21, compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是指因骨量減低與骨組織的微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起的骨骼強(qiáng)度下降、脆性增強(qiáng)疾病，女性絕經(jīng)后，雌性激素缺乏可加速骨吸收，導(dǎo)致骨組織微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。BMSCs在特定的條件下可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等，BMSCs分化成骨細(xì)胞分化受多種因素影響。miR-141-3p可靶向抑制基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)表達(dá)抑制小鼠BMSCs成骨轉(zhuǎn)化[11]。miR-21在雌性激素缺乏狀態(tài)下可以促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化[12]，本研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs miR-21表達(dá)水平降低，miR-21高表達(dá)可以提高BMSCs細(xì)胞增殖、PCNA、Ki67水平，miR-21低表達(dá)呈反向趨勢(shì)。PCNA是可促進(jìn)DNA延伸與合成的核蛋白，對(duì)激活細(xì)胞增殖具有重要意義。Ki67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞核抗原， 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂，說(shuō)明miR-21高表達(dá)可以增強(qiáng)骨質(zhì)疏松癥小鼠BMSCs細(xì)胞增殖能力。

圖5 各組骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs茜素紅染色結(jié)果A：各組骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs 茜素紅染色(×200)，a：Ctrl-pre-miR-NC組，b：OVX-pre-miR-NC組，c：OVX- pre-miR-21組，d：Ctrl-ant-miR-NC組，e：OVX-ant-miR-NC組，f：OVX-ant-miR-21組；B：miR-21高表達(dá)下茜素紅相對(duì)定量，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；C：miR-21低表達(dá)下茜素紅相對(duì)定量，與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.5 Alizarin red staining results of BMSCs in each groupA: Alizarin red staining of BMSCs of osteoporosis mice in each group(× 200), a: Ctrl-pre-Mir-NC group, B: OVX-pre-Mir-NC group, C: OVX-pre-miR-21 group, D: Ctrl-ant-Mir-NC group, e: OVX-ant-Mir-NC group, F: OVX-ant-miR-21 group; B: The relative quantification of Alizarin red under high expression of miR-21. Compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; C: The relative quantification of Alizarin red under low expression of miR-21, compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

圖6 各組骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs Runx2、Osterix水平A：miR-21高表達(dá)下BMSCs(48 h)Runx2、Osterix凝膠成像結(jié)果；B：miR-21低表達(dá)下BMSCs(48 h)Runx2、Osterix凝膠成像結(jié)果；C：A圖蛋白水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；D：B圖蛋白水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.6 Runx2 and Osterix levels of BMSCs in each groupA：Imaging results of BMSCs (48 h) Runx2 and Osterix gel under high expression of miR-21；B：Imaging results of BMSCs (48 h) Runx2 and Osterix gel under low expression of miR-21；C：Figure A statistical results of protein level, compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05；D：Figure B statistical results of protein level; Compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

miR-21缺乏會(huì)降低骨形成速率，延長(zhǎng)骨形成時(shí)間，可通過(guò)影響細(xì)胞增殖與遷移能力來(lái)調(diào)節(jié)骨吸收與破骨細(xì)胞生成能力。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21高表達(dá)可以提高BMSCs細(xì)胞ALP染色程度、ALP活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平，miR-21低表達(dá)呈反向趨勢(shì)。Runx2是早期成骨細(xì)胞分化的骨質(zhì)基因表達(dá)啟動(dòng)子，其表達(dá)降低可抑制成骨形成[13]。Osterix是成骨分化的重要的含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，位于Runx2下游，參與成骨細(xì)胞分化途徑調(diào)控過(guò)程。miR-21可通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)途徑促進(jìn)BMSCs遷移，miR-21表達(dá)水平升高可促進(jìn)大鼠BMSCs增殖、侵襲及分化并修復(fù)心臟損傷[14]，但也有研究[15]認(rèn)為miR-21可促進(jìn)豬外周血干細(xì)胞成脂分化。本研究結(jié)果與前人部分研究結(jié)果相似，認(rèn)為miR-21表達(dá)水平升高可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs增殖、成骨分化，與某些研究結(jié)果一致，可能與物種種類或BMSCs提取部位有關(guān)。

綜上所述，miR-21表達(dá)水平升高可促進(jìn)骨質(zhì)疏松小鼠BMSCs增殖、成骨分化能力，可能與調(diào)節(jié)PCNA、Ki67、Runx2、Osterix水平有關(guān)，但其中具體作用機(jī)制還需要深入研究。