劉樹華 陳桐瑩 趙宇 王世浩 王若琳 張桂鑫 黃宏興 萬雷*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第六臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518034 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510375

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是中老年人常見的疾病，主要特點是骨量丟失加重、骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞，進而導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險增加[1]。骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松性骨折的治療和護理不論對于家庭還是社會都會帶來沉重的負擔(dān)。2015年的一項預(yù)測顯示[2]，2035年我國骨質(zhì)疏松性骨折的醫(yī)療費用將會達到199.2億美元，而到2050年將會達到254.3億美元。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特點為起病隱匿并且進行性發(fā)展，病因迄今未明。據(jù)預(yù)測，到2050年，AD患者將增長到1.35億，約每33 s就會出現(xiàn)一例AD[3-4]。阿爾茨海默癥的治療和護理同樣伴隨著沉重的負擔(dān)。

OP和AD看似兩種發(fā)生在不同系統(tǒng)的相互獨立的疾病，但是兩者都是老年人常見的疾病，同時AD與OP有著共同的影響因素：年齡、睡眠質(zhì)量、吸煙、酗酒、生活經(jīng)濟地位、雌激素水平、運動、體質(zhì)量指數(shù)[5-6]。

關(guān)于OP與AD的關(guān)系，有研究認為AD是OP的危險因素[7]。AD患者面臨骨密度低水平及髖部骨折的風(fēng)險提高近兩倍[8]，由于AD患者晝夜節(jié)律改變，他們活動時間更多集中在晚上，而白天昏昏欲睡，并且這些癥狀隨著認知功能不斷惡化更加明顯，這將導(dǎo)致他們?nèi)狈m當(dāng)?shù)膽敉怏w育鍛煉和陽關(guān)照射，誘發(fā)或加重OP[8-9]。

另有學(xué)者認為OP與AD存在共同致病因素并促進兩病的發(fā)展。AD的一個病理特點是大量β淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)在大腦神經(jīng)細胞外沉積形成老年斑。有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在骨質(zhì)疏松性骨組織中水平升高，且Aβ的表達水平與骨密度水平呈負相關(guān)[7,10]。除此之外，載脂蛋白4(APOE4)是一種主要的膽固醇載體，能夠與Aβ結(jié)合而促進Aβ的沉積，是公認的阿爾茨海默病的遺傳風(fēng)險因素[11]，APOE4基因也被發(fā)現(xiàn)與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)，其中具有APOE 4等位基因的女性患髖部骨折的可能性是沒有APOE 4等位基因的女性的兩倍[12]。關(guān)于Aβ和APOE4基因在AD與OP中的確切關(guān)系仍需要強有力的證據(jù)。這提示可以分析兩病中特異性較高的交集基因探索OP和AD的關(guān)系。

MiRNA是短的非編碼核糖核苷酸，長度為19～25個核苷酸，其作用是通過抑制翻譯或使mRNA降解來調(diào)節(jié)基因的表達[13]。目前研究OP與AD的關(guān)系很少深入到非編碼RNA方面，通過結(jié)合miRNA和生物信息學(xué)研究OP與AD關(guān)系的報道更為稀缺。

本研究通過對基因芯片GSE147232、GSE93883分別進行生物信息學(xué)分析并篩選兩基因芯片DEmiRNAs，分別預(yù)測與這些DEmiRNAs的靶向基因，為闡明OP與AD的關(guān)系以及相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 收集數(shù)據(jù)

從GEO公共數(shù)據(jù)庫中查詢OP與AD患者的基因芯片，下載OP基因芯片GSE93883，芯片包含12個骨質(zhì)疏松癥患者的樣本和6個健康人的樣本，在骨質(zhì)疏松癥患者的樣本中有6例為骨質(zhì)疏松癥伴椎體骨折患者，另外6例為骨質(zhì)疏松癥無椎體骨折患者。本研究將骨質(zhì)疏松不伴椎體骨折患者的樣本和骨質(zhì)疏松伴椎體骨折患者的樣本分別與健康人樣本做獨立分析，其中篩選條件為P<0.05和∣logFC∣≥1，發(fā)現(xiàn)伴椎體骨折患者的DEmiRNAs與不伴椎體骨折患者的DEmiRNAs具有較大的差異，其中OP不伴椎體骨折患者的DEmiRNAs有268個、OP伴椎體骨折患者的DEmiRNAs有270個，但是兩者交集的miRNAs僅有133個。通過檢索相關(guān)文獻，有研究表明骨折后血清中miRNA會發(fā)生相應(yīng)的改變，但無法確定這些miRNA是導(dǎo)致骨折的原因還是發(fā)生骨折后機體產(chǎn)生的其他改變[14]。為了避免椎體骨折后產(chǎn)生的誤差，本研究將基因芯片中6例為骨質(zhì)疏松癥伴椎體骨折患者的樣本舍去。下載AD基因表達芯片GSE147232，芯片包含6個正常老化的樣本和6個阿爾茨海默癥的樣本。

1.2 差異表達的miRNA

使用GEO數(shù)據(jù)庫自帶的GEO2R在線分析(該工具能夠?qū)x定的組別進行分析，自動篩選出差異表達的基因)，篩選出兩個基因芯片DEmiRNAs。對生成的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.01和∣logFC∣≥1作為條件，再用Venny 2.1篩選出OP與AD相交集的DEmiRNAs。

1.3 預(yù)測DEmiRNAs的靶基因

目前用來預(yù)測miRNA靶基因的常用數(shù)據(jù)有TargetScan數(shù)據(jù)庫[15]和miRDB數(shù)據(jù)庫[16]。用以上兩個數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測DEmiRNAs的靶基因，通過TargetScan數(shù)據(jù)中自帶的Total context++ score(該分數(shù)絕對值越大，靶點可能性越大)，按絕對值高低篩選出前200個靶基因；同樣通過miRDB數(shù)據(jù)中自帶的Target Score，按分數(shù)高低篩選出前200個靶基因，再用Venny生成交集基因。

1.4 靶基因富集分析

對篩選后的靶基因進行Gene Ontology(GO)和KEGG 通路分析。GO即基因本體論，是分析基因的常用方法，能通過分析靶基因參與的生物過程(biological pocess，BP)、細胞組分(clular cmponent，CC)及分子功能(molecular function，MF)對靶基因進行分類與注釋。KEGG 通路能分析基因在生物體內(nèi)所參與的代謝過程。本研究使用DAVID數(shù)據(jù)庫的在線分析工具對靶基因進行富集分析[17]。GO各項分析及KEGG 信號通路分析的篩選條件均為P<0.01 。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與模型的構(gòu)建

Cytoscape是將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)可視化的一個軟件。本研究將篩選出來的DEmiRNA與篩選出來的靶基因?qū)隒ytoscape中制作miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。STRING(search tool for the retrieval of interacting genes)為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析工具，能展示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系[18]。

2 結(jié)果

2.1 DEmiRNAs的分析結(jié)果

GEO2R分析后得到10個DEmiRNAs，其中包含hsa-mirplus-c1110，因該miRNA序列目前仍為未知，并且是否存在仍未證實，故在本研究中舍去。DEmiRNAs的變化趨勢與miRNA序列見表1。

表1 篩選后交集的DEmiRNAsTable 1 Differentially expressed miRNAs

2.2 制作miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過上述條件篩選后，得到以下結(jié)果：hsa-miR-4321靶向15個基因，hsa-miR-196a-3p靶向56個基因，hsa-miR-5188靶向7個基因，hsa-miR-4638-5p靶向13個基因，hsa-miR-29b-3p靶向94個基因，hsa-miR-4756-3p靶向47個基因，hsa-miR-3200-3p靶向52個基因，hsa-let-7f-5p靶向13個基因，hsa-miR-550b-3p靶向67個基因。見圖1。

圖1 DEmiRNAs-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.1 DEmiRNAs-mRNA regulatory network注：菱形為miRNA，圓形為靶基因圖形越大，顏色越深(紅)，則Dgree分數(shù)越高。

2.3 GO各項與KEGG 通路的富集分析

富集分析結(jié)果顯示靶基因在BP分析中主要集中在膠原分解代謝過程、細胞外基質(zhì)的組成、膠原原纖維的組成等(表2)；在CC的分析中主要集中在膠原三聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、蛋白質(zhì)細胞外基質(zhì)、基底膜、V型膠原三聚體等(表3)；在MF的分析中集中在細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、血小板衍生生長因子結(jié)合等(表4)；在KEGG pathway的分析中主要集中在蛋白質(zhì)消化吸收、局灶性粘連、ECM受體相互作用、PI3K-Akt等(表5)。

表2 差異靶基因的生物過程分析Table 2 Biological process analysis of differential target genes

表3 差異靶基因的細胞組分分析Table 3 Cell component analysis of differential target genes

表4 差異靶基因的分子功能分析Table 4 Molecular function analysis of differential target genes

表5 差異靶基因KEGG 通路分析Table 5 Analysis of KEGG pathway of differential target genes

2.4 PPI構(gòu)建與核心基因的篩選

將靶基因?qū)隨TRING中進行分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape中，使用其自帶的網(wǎng)絡(luò)分析工具，得到各個基因的連接度(degree)。Degree排名前10的基因定義為核心基因，分別為COL1A1(degree=23)、VEGFA(degree=23)、COL4A1(degree=22)、COL3A1(degree=21)、COL5A1(degree=21)、COL2A1(degree=19)、 LOX(degree=18)、COL7A1(degree=18)、IGF1(degree=18)、COL5A2(degree=17)。使用Cytoscape中的MCODE分析PPI網(wǎng)絡(luò)，得到10個集簇，包含45個節(jié)點和128條連線，并展示score 較高的4組集簇(圖3)。

圖2 靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The PPI network of target genes

圖3 分數(shù)最高的4組集簇(A的分數(shù)為14分，B、C、D的分數(shù)為4分)Fig.3 Four sets of clusters with the highest score(A score=14; B, C, D score=4)

3 討論

3.1 DEmiRNAs分析

本研究通過分析基因芯片GSE93883、GPL18058，得到OP與AD差異表達的miRNA，進而分析OP與AD之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示，degree分數(shù)最高的10個核心基因均為hsa-miR-29b-3p的靶基因，這說明OP與AD之前的關(guān)系與hsa-miR-29b-3p有密切的關(guān)系，或許可以作為診斷和治療兩病的一個方向，值得深入研究。有研究表明miR-29b是骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞分化過程中表達最為明顯的miRNA之一。在BMSCs向成骨細胞分化過程中，miR-29b主要發(fā)揮著兩方面功能。一方面，miR-29b作為成骨途徑的調(diào)節(jié)劑，能促進成骨細胞分化，另一方面，miR-29b充當(dāng)成熟成骨細胞中膠原合成的衰減劑，以維持分化的表型[19]。與此同時，β-位點淀粉樣前體蛋白裂解酶1(Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)能對APP蛋白連續(xù)水解和裂解，是導(dǎo)致Aβ肽積累的重要機制之一，被認為是抑制Aβ肽產(chǎn)生的主要藥物靶點[20]。miR-29b被證實能夠抑制神經(jīng)細胞中BACE1蛋白的表達，進而抑制Aβ肽的產(chǎn)生[21]。因此miR-29可用于治療AD，pre-miR-29b同樣能起到治療AD的作用而且更容易純化[22]。

研究表明單獨使用miRNA難以起到治療效果，將miRNA放入外泌體中能避免miRNA被降解并能高效地發(fā)揮作用。外泌體是直徑為30～120 nm的囊泡，包含多種生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、脂類、代謝產(chǎn)物、mRNA、非編碼RNA[23-25]。用外泌體作為藥物載體時，可以避免潛在的毒性和免疫原性，還能穿透目標(biāo)特定器官[26]。因此由hsa-miR-29b-3p或pre-hsa-miR-29b包裝而成的外泌體或許可以用于治療同時患有OP與AD的患者。hsa-let-7f-5p與hsa-mir-550b-3p對OP與AD的關(guān)系缺乏相關(guān)文獻報道，該miRNA在兩病作用趨勢相反的原因仍需深入研究。

3.2 靶基因分析

10個核心基因中有7個為膠原蛋白家族，大量研究已經(jīng)證明膠原蛋白與骨代謝有重要的關(guān)系。構(gòu)成骨的主要成分為礦物質(zhì)和有機成分，有機成分中Ⅰ型膠原蛋白占90%，Ⅰ型膠原蛋白的含量與OP的發(fā)生密切相關(guān)[27]。除此之外，Ⅰ型膠原代謝產(chǎn)生的Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)、Ⅰ型前膠原羧基端原肽(PICP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTXI)、Ⅰ型膠原交聯(lián)氨基端肽(NTXI)，被廣泛用于衡量骨代謝水平，對早期診治OP有重要的意義[27]，但是膠原蛋白與AD的關(guān)系鮮有報道，因此膠原蛋白與AD的關(guān)系值得深入研究。

在10個核心基因中，Degree排名同為第一的還有VEGFA基因(degree=23)，VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族中的一員，研究表明VEGF是耦合血管生成和成骨所必需的[28]。VEGF存在多種分泌方式來調(diào)節(jié)成骨細胞的功能，在骨重建和骨修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[29]。VEGFA在AD的高危人群中同樣具有保護作用。APOE4等位基因攜帶者是認知下降的高度易感人群，VEGF對APOE-4攜帶者具有獨特的保護作用[30]。

GO富集分析有利于深入認識靶基因的作用和功能，GO各項數(shù)據(jù)表明，靶基因更多富集在膠原蛋白與細胞外基質(zhì)的合成過程中，同時證實膠原蛋白與細胞外基質(zhì)的合成在OP與AD關(guān)系中的重要性。KEGG通路富集分析顯示與PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路有密切關(guān)系。相關(guān)研究表明，PI3K-Akt信號通路與AD有密切關(guān)系，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SODs)能夠防止過量的活性氧形成過氧化氫，而PI3K/AKT途徑已被證明在神經(jīng)保護和通過增強SODs的表達抑制細胞凋亡方面起著關(guān)鍵作用。這種途徑在阿爾茨海默病中至關(guān)重要，因為它能減少tau蛋白的過度磷酸化[31]。相關(guān)研究證實，阿爾茨海默癥和輕度認知障礙受試者的下頂葉的PI3K/Akt/mTOR軸過度活躍[32]。

而對于OP，PI3K/AKT通路被證明能夠調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化與凋亡，并能夠促進成骨細胞增殖和分化，達到抑制OP的效果[33]。mTOR是屬于磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)相關(guān)激酶家族中一員，mTOR與不同的蛋白結(jié)合，能形成功能不同的復(fù)合物，主要為mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)。研究證實mTORC1通過抑制NF-κb和NFATc1的相關(guān)通路來抑制破骨細胞分化，而這兩個因子都是破骨細胞生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[34]。

3.3 OP與AD的關(guān)系

綜合各因素，包括：①OP與AD有許多共同的影響因素，其中年齡、睡眠質(zhì)量、吸煙、酗酒、生活經(jīng)濟地位、雌激素水平、運動在兩病的影響是相同的，僅體質(zhì)量指數(shù)的影響是相反[5-6]；②9個DEmiRNAs中有7個miRNA的變化趨勢呈正相關(guān)，只有2個miRNA為負相關(guān)，而且miR-29b-3p作為關(guān)鍵miRNA，靶向10個核心基因，其的變化關(guān)系在兩病中為正相關(guān)；③通過查找相關(guān)文獻和報道，預(yù)測的靶基因大部分對兩病的作用趨勢也是相同的。因此認為OP與AD存在正相關(guān)關(guān)系，膠原蛋白的缺乏或許是兩疾病的共同病因，而由miR-29b-3p或pre-hsa-miR-29b包裝而成的外泌體或許可以作為OP和AD新的治療手段。