肖建生 張鵬 趙洪洲 鐘俊青

1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070 2.天津醫(yī)院骨科，天津 361000

地塞米松(dexamethasone，Dex)是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，具有很強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用，是治療發(fā)炎和自身免疫性疾病的常用藥物[1]，與其他糖皮質(zhì)激素一樣，地塞米松對成骨細(xì)胞具有毒性作用，如低鈣飼料加上1 mg/kg地塞米松每3 d一次持續(xù)6周即足有構(gòu)建骨質(zhì)疏松的大鼠模型[2]。探索地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的機(jī)制并制定干預(yù)策略是目前的研究重點(diǎn)[3]。糖原合成酶激酶3B(glycogen synthase kinase 3B，GSK3B)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與了細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡的調(diào)控[4]，是成骨細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控蛋白[5]。miR-135b是一種參與了地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的小分子非編碼RNA，然而miR-135b對成骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控是否與GSK3B有關(guān)還未見報道[6]。本研究探索miR-135b在地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

地塞米松從美國Sigma公司購得，DMEM培養(yǎng)基從美國Hyclone公司購得，RIPA試劑、Trizol試劑、BCA蛋白定量試劑盒、CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒從上海碧云天生物技術(shù)有限公司購得，雙熒光素酶報告檢測試劑盒從美國Promega公司購得，反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR Premix EX Taq Ⅱ從日本Takara公司購得，GSK3B一抗從英國Abcam公司購得，Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9一抗及二抗從美國Santa Cruz公司購得，β-actin抗體從美國Bosterbio公司購得，實(shí)驗(yàn)所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，孵育箱溫度37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，每2 d更換一次完全培養(yǎng)基。對于CCK-8，細(xì)胞經(jīng)過濃度梯度的地塞米松處理24 h，加入10 μL CCK8試劑反應(yīng)4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光值。細(xì)胞分為對照組(Control)、地塞米松組(Dex)、陰性對照mimics組(mimics NC)、miR-135b組、miR-135b+pc-GSK3B組，按說明根據(jù)分組加藥和轉(zhuǎn)染，24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 動物實(shí)驗(yàn)

SD雄性SPF大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，由本院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于通風(fēng)良好，恒溫恒濕的籠具中，籠具、墊料、食物和水均經(jīng)過滅菌處理，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間水和食料自由獲取。隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組(Control)、模型組(Model)、miR-135b組，每組10只。模型組臀肌注射10 mg/kg地塞米松注射液，每周1次；miR-135b組除注射地塞米松注射液以外，還通過尾靜脈注射給予miR-135b antagomir，每周一次；對照組注射等量生理鹽水，持續(xù)8周。處死大鼠取雙側(cè)股骨頭，通過X射線骨密度儀檢測股骨頭密度。對于HE染色，多聚甲醛固定后按常規(guī)方法染色和觀察。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

使用Annexin V-FITC結(jié)合液懸浮細(xì)胞后，根據(jù)試劑盒提供的操作說明，加入Annexin V-FITC試劑和PI，使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。

1.5 RT-qPCR

使用Trizol試劑提取細(xì)胞或組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，通過SYBR Premix EX Taq Ⅱ試劑盒PCR檢測基因表達(dá)，擴(kuò)增條件按如下程序設(shè)置：95 ℃ 2 min，之后95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s 40個循環(huán)，2-ΔΔCt法進(jìn)行計算基因表達(dá)水平。

1.6 蛋白印跡檢測蛋白表達(dá)

蛋白用RIPA裂解液提取，BCA液校準(zhǔn)，10% SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并通過5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉處理2 h，棄去液體，加入適量一抗于4 ℃孵育，次日通過TBST緩沖液浸洗膜，棄去液體后二抗孵育2 h，ECL顯色液顯影。通過凝膠成像儀對各條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

構(gòu)建GSK3B 3’-UTR pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型載體(MUT)，將載體同mimics NC或miR-135b mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 5進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松對MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響

研究發(fā)現(xiàn)地塞米松濃度高于50 μmol/L時，MC3T3-E1細(xì)胞活力抑制明顯(P<0.05)，IC50約為500 μmol/L，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。見圖1。

圖1 CCK8檢測地塞米松對成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞活力的抑制作用Fig.1 Viability of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone注：n=3，與0 μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 地塞米松對MC3T3-E1細(xì)胞凋亡以及miR-135b和GSK3B表達(dá)的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)，見圖2A；miR-135b表達(dá)水平降低(P<0.01)，見圖2B；GSK3B mRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)，見圖2C。

圖2 地塞米松對MC3T3-E1細(xì)胞凋亡以及miR-135b和GSK3B表達(dá)的影響A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B：RT-qPCR檢測miR-135b表達(dá)；C：RT-qPCR檢測GSK3B mRNA表達(dá)Fig.2 Apoptosis, and levels of miR-135b and GSK3B of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone. (A) Apoptosis tested with flow cytometry. RNA levels of miR-135b (B) and GSK3B (C) were tested with RT-qPCR.注：n=6，與Control組比較，**P<0.01。

2.3 miR-135b與GSK3B靶向作用關(guān)系

如圖3A所示，通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-135b和GSK3B存在靶向作用關(guān)系。如圖3B所示，與GSK3B WT+mimics NC組比較，GSK3B WT+miR-135b組細(xì)胞中熒光素酶活性降低(P<0.01)，而GSK3B MUT+mimics NC組和GSK3B MUT+miR-135b組比較，細(xì)胞熒光素酶活性無顯著差異。

圖3 miR-135b與GSK3B靶向作用關(guān)系A(chǔ)：miR-135b和GSK3B靶向序列的Targetscan預(yù)測；B：熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測miR-135b和GSK3B靶向作用Fig.3 Targeting of GSK3B with miR-135b. (A) The targeting relationship predicted with Targetscan. RNA levels of miR-135b (B) Targeting of GSK3B with miR-135b validated with luciferase reporter assay.注：n=6，與GSK3B WT+mimics NC組比較，**P<0.01。

2.4 miR-135b對地塞米松誘導(dǎo)GSK3B蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細(xì)胞miR-135b表達(dá)水平降低(P<0.01)，miR-135b組miR-135b表達(dá)水平升高(P<0.01)，見圖4A；與Control組比較，Dex組GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)，與Dex組比較， miR-135b組GSK3B蛋白水平降低(P<0.01)，與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)，見圖4B。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-135b對MC3T3-E1細(xì)胞GSK3B蛋白表達(dá)的影響A：RT-qPCR檢測miR-135b轉(zhuǎn)染效率；B：蛋白印跡檢測GSK3B蛋白表達(dá)Fig.4 MC3T3-E1 cell expression of GSK3B protein when transfected with miR-135b. (A) Transfection validated with RT-qPCR. (B) GSK3B expression tested with western blotting.注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.5 miR-135b對地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)；與Dex比較，miR-135b組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)；與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)。見圖5。

圖5 miR-135b對地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響A：流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡；B：細(xì)胞凋亡率Fig.5 Apoptosis of dexamethasone (Dex) challenged MC3T3-E1 cells treated with miR-135b. (A) apoptosis tested with flow cytometry. (B) Apoptotic cell rates.注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.6 miR-135b對地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞Bax和Bcl-2水平影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細(xì)胞Bax蛋白水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01)；與Dex組比較，miR-135b組Bax蛋白水平降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.01)；與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組Bax蛋白水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01)。見圖6。

圖6 蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.6 Bax and Bcl-2 expression tested with Western blotting注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.7 miR-135b對地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞cleaved caspase-3和cleaved caspase-9水平的影響

與Control組比較，Dex組MC3T3-E1細(xì)胞中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01)；與Dex組比較，miR-135b組中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平降低(P<0.01)；與miR-135b組比較，miR-135b+pc-GSK3B組中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01)。見圖7。

圖7 蛋白印跡檢測CASP3和CASP9蛋白活化Fig.7 CASP3 and CASP9 expression tested with Western blotting注：n=6，與Control組比較，**P<0.01；與Dex組比較，##P<0.01；與miR-135b組比較，&&P<0.01。

2.8 miR-135b降低模型大鼠股骨頭組織中GSK3B蛋白表達(dá)

與Control組比較，Model組大鼠股骨頭組織中miR-135b表達(dá)水平降低(P<0.01)，同時GSK3B蛋白水平升高(P<0.01)；與Model組比較，miR-135b組大鼠股骨頭組織中miR-135b表達(dá)水平升高(P<0.01)，同時GSK3B蛋白水平降低(P<0.01)。見圖8。

圖8 轉(zhuǎn)染miR-135b對股骨頭組織GSK3B表達(dá)的影響Fig.8 Expression of GSK3B in the femoral head transfected with miR-135b注：n=10，與Control組比較，**P<0.01；與Model組比較，##P<0.01。

2.9 miR-135b恢復(fù)模型大鼠股骨頭骨密度

與Control組比較，Model組大鼠股骨頭骨密度降低(P<0.01)，經(jīng)過miR-135b作用后，與Model組比較，miR-135b組大鼠股骨頭骨密度升高(P<0.01)。見圖9。

圖9 miR-135b對股骨頭骨密度的影響Fig.9 Effect of miR-135b on bone mineral density of the femoral head注：n=10，與Control組比較，**P<0.01；與Model組比較，##P<0.01。

2.10 miR-135b減輕股骨頭組織病變

對照組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)完好；模型組可觀察到骨小梁纖細(xì)，排列紊亂，空骨陷窩增多，骨細(xì)胞萎縮，并出現(xiàn)脂肪滴和嗜酸性粒細(xì)胞的聚集；miR-135b組雖然也出現(xiàn)了上述病變，但程度明顯減輕。見圖10。

圖10 miR-135b對股骨頭組織病變的影響(×200)Fig.10 Effect of miR-135b on pathological changes of the femoral head (200×).

3 討論

糖皮質(zhì)激素常被用于炎癥或自身免疫疾病的治療中[7-8]。過量的糖皮質(zhì)激素常常會抑制成骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并最終導(dǎo)致非創(chuàng)傷性骨壞死[9]。地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的能力與GSK3B有關(guān)[5,10]。Fan等[6]研究表明，miR-135b具有保護(hù)成骨細(xì)胞免受地塞米松誘導(dǎo)損傷的功能，盡管Xiao等[11]在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)miR-135b與GSK3B可能存在靶向作用關(guān)系，然而miR-135b對成骨細(xì)胞的保護(hù)作用是否與靶向作用于GSK3B還未見報道。本研發(fā)現(xiàn)經(jīng)過地塞米松處理后，MC3T3-E1細(xì)胞凋亡水平增加，與此同時細(xì)胞中miR-135b表達(dá)水平下調(diào)而GSK3B表達(dá)水平上調(diào)，這一結(jié)果表明地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡與miR-135b和GSK3B的表達(dá)可能存在聯(lián)系。進(jìn)一步通過熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-135b可靶向作用于GSK3B。

GSK3B激活與成骨細(xì)胞的凋亡有著緊密聯(lián)系，糖皮質(zhì)激素可通過激活GSK3B誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，siRNA敲低GSK3B表達(dá)可降低Bax和caspase-3表達(dá)并增加Bcl-2表達(dá)[12]，這類過程最終抑制細(xì)胞凋亡[13-14]。為了進(jìn)一步探究miR-135b和GSK3B對地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-135b mimics和GSK3B過表達(dá)載體對地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)miR-135b水平升高可減少細(xì)胞凋亡率，同時抑制GSK3B、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平，并升高Bcl-2蛋白水平，而GSK3B過表達(dá)可扭轉(zhuǎn)miR-135b水平升高引起的上述變化。

綜上，本研究證實(shí)了miR-135b可通過靶向抑制GSK3B，抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。