肖建生 張鵬 趙洪洲 鐘俊青
1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院,天津 300070 2.天津醫(yī)院骨科,天津 361000
地塞米松(dexamethasone,Dex)是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素,具有很強的抗炎和免疫抑制作用,是治療發(fā)炎和自身免疫性疾病的常用藥物[1],與其他糖皮質(zhì)激素一樣,地塞米松對成骨細(xì)胞具有毒性作用,如低鈣飼料加上1 mg/kg地塞米松每3 d一次持續(xù)6周即足有構(gòu)建骨質(zhì)疏松的大鼠模型[2]。探索地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的機制并制定干預(yù)策略是目前的研究重點[3]。糖原合成酶激酶3B(glycogen synthase kinase 3B,GSK3B)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與了細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡的調(diào)控[4],是成骨細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控蛋白[5]。miR-135b是一種參與了地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的小分子非編碼RNA,然而miR-135b對成骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控是否與GSK3B有關(guān)還未見報道[6]。本研究探索miR-135b在地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中可能的作用機制。
地塞米松從美國Sigma公司購得,DMEM培養(yǎng)基從美國Hyclone公司購得,RIPA試劑、Trizol試劑、BCA蛋白定量試劑盒、CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒從上海碧云天生物技術(shù)有限公司購得,雙熒光素酶報告檢測試劑盒從美國Promega公司購得,反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR Premix EX Taq Ⅱ從日本Takara公司購得,GSK3B一抗從英國Abcam公司購得,Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9一抗及二抗從美國Santa Cruz公司購得,β-actin抗體從美國Bosterbio公司購得,實驗所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,孵育箱溫度37 ℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%,每2 d更換一次完全培養(yǎng)基。對于CCK-8,細(xì)胞經(jīng)過濃度梯度的地塞米松處理24 h,加入10 μL CCK8試劑反應(yīng)4 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光值。細(xì)胞分為對照組(Control)、地塞米松組(Dex)、陰性對照mimics組(mimics NC)、miR-135b組、miR-135b+pc-GSK3B組,按說明根據(jù)分組加藥和轉(zhuǎn)染,24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。
SD雄性SPF大鼠30只,體質(zhì)量(200±20)g,由本院實驗動物中心提供,飼養(yǎng)于通風(fēng)良好,恒溫恒濕的籠具中,籠具、墊料、食物和水均經(jīng)過滅菌處理,大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,期間水和食料自由獲取。隨機數(shù)字表法隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)、miR-135b組,每組10只。模型組臀肌注射10 mg/kg地塞米松注射液,每周1次;miR-135b組除注射地塞米松注射液以外,還通過尾靜脈注射給予miR-135b antagomir,每周一次;對照組注射等量生理鹽水,持續(xù)8周。處死大鼠取雙側(cè)股骨頭,通過X射線骨密度儀檢測股骨頭密度。對于HE染色,多聚甲醛固定后按常規(guī)方法染色和觀察。
使用Annexin V-FITC結(jié)合液懸浮細(xì)胞后,根據(jù)試劑盒提供的操作說明,加入Annexin V-FITC試劑和PI,使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡進行檢測。
使用Trizol試劑提取細(xì)胞或組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,通過SYBR Premix EX Taq Ⅱ試劑盒PCR檢測基因表達,擴增條件按如下程序設(shè)置:95 ℃ 2 min,之后95 ℃ 5 s,60 ℃ 10 s 40個循環(huán),2-ΔΔCt法進行計算基因表達水平。
蛋白用RIPA裂解液提取,BCA液校準(zhǔn),10% SDS-PAGE電泳分離,半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,并通過5%牛血清白蛋白進行封閉處理2 h,棄去液體,加入適量一抗于4 ℃孵育,次日通過TBST緩沖液浸洗膜,棄去液體后二抗孵育2 h,ECL顯色液顯影。通過凝膠成像儀對各條帶進行灰度分析。
構(gòu)建GSK3B 3’-UTR pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型載體(MUT),將載體同mimics NC或miR-135b mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,24 h后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。
數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 5進行統(tǒng)計分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組比較采用t檢驗,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
研究發(fā)現(xiàn)地塞米松濃度高于50 μmol/L時,MC3T3-E1細(xì)胞活力抑制明顯(P<0.05),IC50約為500 μmol/L,因此后續(xù)實驗采用200 μmol/L作為實驗濃度。見圖1。
圖1 CCK8檢測地塞米松對成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞活力的抑制作用Fig.1 Viability of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone注:n=3,與0 μmol/L組比較,*P<0.05,**P<0.01。
與Control組比較,Dex組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01),見圖2A;miR-135b表達水平降低(P<0.01),見圖2B;GSK3B mRNA表達水平升高(P<0.01),見圖2C。
圖2 地塞米松對MC3T3-E1細(xì)胞凋亡以及miR-135b和GSK3B表達的影響A:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;B:RT-qPCR檢測miR-135b表達;C:RT-qPCR檢測GSK3B mRNA表達Fig.2 Apoptosis, and levels of miR-135b and GSK3B of MC3T3-E1 cells treated with dexamethasone. (A) Apoptosis tested with flow cytometry. RNA levels of miR-135b (B) and GSK3B (C) were tested with RT-qPCR.注:n=6,與Control組比較,**P<0.01。
如圖3A所示,通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-135b和GSK3B存在靶向作用關(guān)系。如圖3B所示,與GSK3B WT+mimics NC組比較,GSK3B WT+miR-135b組細(xì)胞中熒光素酶活性降低(P<0.01),而GSK3B MUT+mimics NC組和GSK3B MUT+miR-135b組比較,細(xì)胞熒光素酶活性無顯著差異。
圖3 miR-135b與GSK3B靶向作用關(guān)系A(chǔ):miR-135b和GSK3B靶向序列的Targetscan預(yù)測;B:熒光素酶報告實驗檢測miR-135b和GSK3B靶向作用Fig.3 Targeting of GSK3B with miR-135b. (A) The targeting relationship predicted with Targetscan. RNA levels of miR-135b (B) Targeting of GSK3B with miR-135b validated with luciferase reporter assay.注:n=6,與GSK3B WT+mimics NC組比較,**P<0.01。
與Control組比較,Dex組MC3T3-E1細(xì)胞miR-135b表達水平降低(P<0.01),miR-135b組miR-135b表達水平升高(P<0.01),見圖4A;與Control組比較,Dex組GSK3B蛋白水平升高(P<0.01),與Dex組比較, miR-135b組GSK3B蛋白水平降低(P<0.01),與miR-135b組比較,miR-135b+pc-GSK3B組GSK3B蛋白水平升高(P<0.01),見圖4B。
圖4 轉(zhuǎn)染miR-135b對MC3T3-E1細(xì)胞GSK3B蛋白表達的影響A:RT-qPCR檢測miR-135b轉(zhuǎn)染效率;B:蛋白印跡檢測GSK3B蛋白表達Fig.4 MC3T3-E1 cell expression of GSK3B protein when transfected with miR-135b. (A) Transfection validated with RT-qPCR. (B) GSK3B expression tested with western blotting.注:n=6,與Control組比較,**P<0.01;與Dex組比較,##P<0.01;與miR-135b組比較,&&P<0.01。
與Control組比較,Dex組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01);與Dex比較,miR-135b組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01);與miR-135b組比較,miR-135b+pc-GSK3B組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)。見圖5。
圖5 miR-135b對地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響A:流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡;B:細(xì)胞凋亡率Fig.5 Apoptosis of dexamethasone (Dex) challenged MC3T3-E1 cells treated with miR-135b. (A) apoptosis tested with flow cytometry. (B) Apoptotic cell rates.注:n=6,與Control組比較,**P<0.01;與Dex組比較,##P<0.01;與miR-135b組比較,&&P<0.01。
與Control組比較,Dex組MC3T3-E1細(xì)胞Bax蛋白水平升高(P<0.01),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01);與Dex組比較,miR-135b組Bax蛋白水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.01);與miR-135b組比較,miR-135b+pc-GSK3B組Bax蛋白水平升高(P<0.01),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.01)。見圖6。
圖6 蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2蛋白表達Fig.6 Bax and Bcl-2 expression tested with Western blotting注:n=6,與Control組比較,**P<0.01;與Dex組比較,##P<0.01;與miR-135b組比較,&&P<0.01。
與Control組比較,Dex組MC3T3-E1細(xì)胞中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01);與Dex組比較,miR-135b組中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平降低(P<0.01);與miR-135b組比較,miR-135b+pc-GSK3B組中cleaved caspase-3與cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.01)。見圖7。
圖7 蛋白印跡檢測CASP3和CASP9蛋白活化Fig.7 CASP3 and CASP9 expression tested with Western blotting注:n=6,與Control組比較,**P<0.01;與Dex組比較,##P<0.01;與miR-135b組比較,&&P<0.01。
與Control組比較,Model組大鼠股骨頭組織中miR-135b表達水平降低(P<0.01),同時GSK3B蛋白水平升高(P<0.01);與Model組比較,miR-135b組大鼠股骨頭組織中miR-135b表達水平升高(P<0.01),同時GSK3B蛋白水平降低(P<0.01)。見圖8。
圖8 轉(zhuǎn)染miR-135b對股骨頭組織GSK3B表達的影響Fig.8 Expression of GSK3B in the femoral head transfected with miR-135b注:n=10,與Control組比較,**P<0.01;與Model組比較,##P<0.01。
與Control組比較,Model組大鼠股骨頭骨密度降低(P<0.01),經(jīng)過miR-135b作用后,與Model組比較,miR-135b組大鼠股骨頭骨密度升高(P<0.01)。見圖9。
圖9 miR-135b對股骨頭骨密度的影響Fig.9 Effect of miR-135b on bone mineral density of the femoral head注:n=10,與Control組比較,**P<0.01;與Model組比較,##P<0.01。
對照組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)完好;模型組可觀察到骨小梁纖細(xì),排列紊亂,空骨陷窩增多,骨細(xì)胞萎縮,并出現(xiàn)脂肪滴和嗜酸性粒細(xì)胞的聚集;miR-135b組雖然也出現(xiàn)了上述病變,但程度明顯減輕。見圖10。
圖10 miR-135b對股骨頭組織病變的影響(×200)Fig.10 Effect of miR-135b on pathological changes of the femoral head (200×).
糖皮質(zhì)激素常被用于炎癥或自身免疫疾病的治療中[7-8]。過量的糖皮質(zhì)激素常常會抑制成骨細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并最終導(dǎo)致非創(chuàng)傷性骨壞死[9]。地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的能力與GSK3B有關(guān)[5,10]。Fan等[6]研究表明,miR-135b具有保護成骨細(xì)胞免受地塞米松誘導(dǎo)損傷的功能,盡管Xiao等[11]在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)miR-135b與GSK3B可能存在靶向作用關(guān)系,然而miR-135b對成骨細(xì)胞的保護作用是否與靶向作用于GSK3B還未見報道。本研發(fā)現(xiàn)經(jīng)過地塞米松處理后,MC3T3-E1細(xì)胞凋亡水平增加,與此同時細(xì)胞中miR-135b表達水平下調(diào)而GSK3B表達水平上調(diào),這一結(jié)果表明地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡與miR-135b和GSK3B的表達可能存在聯(lián)系。進一步通過熒光素酶報告實驗,驗證miR-135b可靶向作用于GSK3B。
GSK3B激活與成骨細(xì)胞的凋亡有著緊密聯(lián)系,糖皮質(zhì)激素可通過激活GSK3B誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,siRNA敲低GSK3B表達可降低Bax和caspase-3表達并增加Bcl-2表達[12],這類過程最終抑制細(xì)胞凋亡[13-14]。為了進一步探究miR-135b和GSK3B對地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其相關(guān)機制,本研究通過轉(zhuǎn)染miR-135b mimics和GSK3B過表達載體對地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1進行干預(yù),發(fā)現(xiàn)miR-135b水平升高可減少細(xì)胞凋亡率,同時抑制GSK3B、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平,并升高Bcl-2蛋白水平,而GSK3B過表達可扭轉(zhuǎn)miR-135b水平升高引起的上述變化。
綜上,本研究證實了miR-135b可通過靶向抑制GSK3B,抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。