曾紹妤

（北海市衛(wèi)生學(xué)校附屬醫(yī)院，廣西 北海，536000）

2019年12月湖北省武漢市報告一批不明原因肺炎聚集病例，隨后經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心調(diào)查[1]，依據(jù)病毒基因組序列和病毒分離結(jié)果，確認該病原體為一種新型冠狀病毒。并歸屬為β冠狀病毒，與2003年出現(xiàn)急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒、2012年中東呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒存在明顯差異性，被命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2，相關(guān)疾病稱之為2019 冠狀病毒（COVID-19）[2]。對上述傳播能力較大病原體，及時、準確實驗室診斷為確定個體感染狀態(tài)、妥善進行患者治療及管理、調(diào)查病毒傳播途徑、控制進一步傳播等諸多方面重要環(huán)節(jié)[3]。核酸檢測方法具有高靈敏度、低假陽性率優(yōu)勢，相比較其他檢測方式應(yīng)用效果更佳。本文就新型冠狀病毒核酸檢測的研究進展如下闡述，具體如下。

1.測序技術(shù)

第二代基因測序技術(shù)可短時間內(nèi)實現(xiàn)高通量的未知基因組測序。2019-nCoV 經(jīng)患者呼吸道分泌物提取病毒ENA，構(gòu)建cDNA 文庫開展高通量測序，后續(xù)開展基因組比對分析確定新型冠狀病毒。對其優(yōu)勢分析得出，可確定未知樣本序列，疫情爆發(fā)初期階段應(yīng)用價值高。對高度疑似及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)診斷陰性病例，測序技術(shù)可提升準確性，判斷是否合并其他病原體。同時可用于判斷病毒是否變異，以便改進檢測手段[4]。但實際操作中，測序技術(shù)對儀器、人員要求高，檢測時間長且費用高，不適用于人群大規(guī)模篩查。納米孔靶向測序技術(shù)作為單分子實時測序技術(shù)，經(jīng)DNA、RNA 生物納米孔時產(chǎn)生電流變化開展堿性測序，配合小型實時測序設(shè)備，可用于即時檢測[5]。納米孔靶向測序技術(shù)靈敏度高于熒光定量PCR100 倍，檢測范圍廣、成本低，反應(yīng)速度快，可作為其他檢測方法無效快速診斷選擇。

2.PCR 技術(shù)

實時熒光定量PCR 歸屬為第二代PCR 技術(shù)，定量檢測核酸。利用核酸擴增產(chǎn)生擴增曲線定量計算初始濃度，常見為熒光染料法、TaqMan 探針法。實時熒光定量PCR 作為WHO、中國國家衛(wèi)生健康委員會等單位推薦新冠肺炎確診標準之一。但大規(guī)模檢測結(jié)果得出，實時熒光定量PCR 存在一定“假陰性”問題，陽性檢出率僅為30%[6]。對其原因分析得出，與待測樣本病毒載量低于常規(guī)實時熒光定量PCR 檢出限，如何提高靈敏度成為需解決關(guān)鍵。微滴式數(shù)字PCR 相比較第二代，在絕對定量檢測方面準確性、靈敏度顯著偏高，在腫瘤突變基因檢測、病原體檢測等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。相比較傳統(tǒng)PCR 技術(shù)，微滴式數(shù)字PCR 每一條模板“單分子擴增”產(chǎn)生信號進行分析實現(xiàn)定量，可提高靈敏度[7]。且樣本分散產(chǎn)生液滴越多，則體積越小，檢出靈敏度越高。同時，與傳統(tǒng)PCR 比較，微滴式數(shù)字PCR 對殘留樣本中蛋白、多糖抵抗作用更強，抑制作用削弱，相對檢出率更高。

3.核酸等溫擴增技術(shù)

核酸等溫擴增技術(shù)無需熱循環(huán)儀，擴增反應(yīng)效率高、速度快，適用于病原體核酸的現(xiàn)場快速檢測。因此，許多核酸等溫擴增方法被用于2019-nCoV 檢測[8]。依賴核酸序列的擴增技術(shù)（NASBA）可直接對RNA 靶標擴增等溫擴增技術(shù)，利用含有T7啟動子的逆轉(zhuǎn)錄引物將RNA靶標逆轉(zhuǎn)錄為含有T7啟動子的cDNA，經(jīng)T7 RNA 聚合酶對cDNA 進行轉(zhuǎn)錄擴增，得到大量RNA 擴增產(chǎn)物，合成RNA 擴增產(chǎn)物重新進入逆轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄擴增循環(huán)。在41℃進行，進入循環(huán)擴增反應(yīng)前需在65℃進行引物退火。NASBA 可在1.5～2h 內(nèi)將靶標擴增6～9 個數(shù)量級，靈敏度達到單拷貝/反應(yīng)[9]。NASBA 技術(shù)作為DNA 靶標擴增，但DNA 靶標預(yù)變性過程會促使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，仍需重新補加才可進行后續(xù)反應(yīng)。且時間較長，流程復(fù)雜，多在實驗室環(huán)境下進行RNA 檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）為2000年所提出一種核酸等溫擴增技術(shù)，反應(yīng)在60～65℃下，靈敏度達到10 拷貝/反應(yīng)。有學(xué)者開發(fā)SARS-CoV-2 可視化檢測方法，以鈣黃綠素作為LAMP 擴增產(chǎn)物檢測試劑，1h 內(nèi)實現(xiàn)對20 拷貝/反應(yīng)和200 拷貝/反應(yīng)的SARS-CoV-2 基因組ORF 1ab 和S 基因靶標的檢測?？蓪崿F(xiàn)多重病原體組和篩查，同時可利用肉眼觀察顏色變化判讀結(jié)果，降低對儀器設(shè)備要求，適用于資源有限及經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)開展核酸檢測[10]。但經(jīng)肉眼主觀判斷顏色變化存在較大個體主觀判斷差異，極易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，使得上述檢測方法準確性受到影響。

4.小結(jié)

檢測技術(shù)從實驗室至臨床需經(jīng)歷四個階段，概念認證階段、少量樣本分析階段、大量患者參與臨床實驗階段及技術(shù)商業(yè)化階段。自疫情爆發(fā)以來，臨床有關(guān)各式2019-nCoV 檢測方法層出不窮，但目前多數(shù)停留在第二步少量樣本分析階段，尚未真正商業(yè)化運用。目前有關(guān)RT-PCR 方式被質(zhì)疑準確性不佳，但血清免疫學(xué)檢測無法用于低病毒載量、無癥狀感染者篩查，PCR技術(shù)發(fā)展，可提高靈敏度，但目前尚未作為商業(yè)應(yīng)用。有關(guān)RT-PCR 核酸檢測試劑盒能及時滿足臨床需要情況下，仍需考慮如何提高2019-nCoV 檢測技術(shù)靈敏度，準確性及通量，實現(xiàn)全自動流水線式操作，滿足臨床篩查需求。