祝波 楊玉濤 楊梅 馬武開 姚血明 黃穎 寧喬怡 蔣光芬 王璐 高雪琴

(1.貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025;2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴陽 550003)

風濕病是指由于各種原因而引起骨、關節(jié)和周圍的軟組織，如肌肉、腱、滑膜和筋膜，疼痛較多的疾病[1]。本文主要對代謝組學的質(zhì)譜檢測技術在于風濕性免疫系統(tǒng)疾病(如骨關節(jié)炎、痛風性骨關節(jié)炎、類風濕性骨關節(jié)炎、系統(tǒng)性下肢紅斑狼瘡、強直性柱炎)代謝標志物的篩選的研究進行歸納及展望。報告如下。

1 質(zhì)譜技術的分類、原理及優(yōu)勢

質(zhì)譜,通常又被廣泛稱為分子質(zhì)譜法,臨床上常用的方法是有機質(zhì)譜激光儀器,如液相化學色譜-質(zhì)子基譜激光聯(lián)用儀(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)子基譜激光聯(lián)用儀(GC-MS)、傅里葉時間變換激光質(zhì)譜儀(FT-MS)以及輔助基質(zhì)激光輔助質(zhì)譜激光用于解吸太空飛行器的時間變換質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)等四大質(zhì)譜類。它主要功能是將分析樣品中的分子轉(zhuǎn)化成各種帶電中性離子,并通過利用樣品相應的離子電場、磁場原理來準確實現(xiàn)中性離子鍵與m/z鍵的分離,從而準確檢測每種中性離子的帶電峰值和強度也是進行離子物質(zhì)化學分析的一種儀器。與其他傳統(tǒng)生化免疫分析方法相比，該方法具有特異性高、靈敏度高、檢測限低、分析速度快等明顯優(yōu)勢，使其在臨床微生物標記物的檢測方面極具潛力，篩選作用高效，可應用于臨床免疫生物學、分子生物診斷、臨床生物化學研究、微生物檢驗研究等方面[2]。

2 質(zhì)譜技術在風濕性疾病的相關應用

2.1骨性關節(jié)炎(osteoarthitis,OA) 骨關節(jié)炎是以關節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關節(jié)病，主要由關節(jié)軟骨細胞、軟骨外基質(zhì)、軟骨下骨質(zhì)合成及降解的平衡破壞導致的，多見于中老年人[3]。目前對骨關節(jié)炎發(fā)病的發(fā)病的分子尚不完全明確，且對其生物標記物的研究的報道并不是很多。通過 GC-MS 對骨關節(jié)炎患者的尿液進行研究，發(fā)現(xiàn)患者尿液中的三羧酸循環(huán)(TCA)呈上調(diào)趨勢的原因與骨關節(jié)炎相關[4]。余光書等基于質(zhì)譜技術分析軟骨細胞線粒體蛋白質(zhì)及細胞凋亡機制的研究，對膝關節(jié)表面置換術患者的關節(jié)軟骨組織提取線粒體進行分析鑒定，共發(fā)現(xiàn)294個蛋白質(zhì)點的蛋白質(zhì)有ATP合酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脫氫酶1等14種蛋白質(zhì)存在于此線粒體并對軟骨細胞線粒體中的蛋白質(zhì)作全面的定性觀察[5]。Carlson AK等運用高效液相色譜-質(zhì)譜法對骨關節(jié)炎患者及健康人的關節(jié)滑液進行整體代謝組譜分析，確定35種代謝物為骨關節(jié)炎的潛在生物標志物[6]。Zhang在OA患者的關節(jié)滑液中發(fā)現(xiàn)6種差異代謝分子并證實谷氨酰胺、 5-脫水葡糖醇以及葡萄糖內(nèi)酯組合可顯著區(qū)分OA患者與健康人群，單-分子葡萄糖內(nèi)酯則可有效區(qū)分OA與RA患者[7]。運用超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(UPLC/Q-TOF-MS)對重度骨關節(jié)炎患者的硬化的軟骨下骨進行檢測分析，其中與軟骨下骨硬化密切相關為?；撬?、β-丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、嘧啶、嘌呤、神經(jīng)鞘脂，而與骨關節(jié)炎軟骨下骨硬化最為相關為牛磺酸、β-丙氨酸,并發(fā)現(xiàn)左旋肉堿、牛磺酸、甘油磷脂等分子在軟骨下骨硬化的發(fā)病機制中有著重要的調(diào)節(jié)作用；而β-丙氨酸和左旋肉堿最有可能是軟骨下骨硬化的耗能代謝物[8]。綜上質(zhì)譜技術在骨性關節(jié)炎疾病鑒定和對生物細胞標記物的研究過程中一直起著至關重要的指導作用,通過質(zhì)譜鑒定提取出有重要意義的差異生物標記物并對其分別進行該病相關細胞生物學和代謝因子通路的分析研究,將極大有助于初步了解該相關疾病的具體發(fā)病變化機制,對于早期疾病診斷及初步探尋該病相關的臨床靶向生物治療方法提供了可靠的科學依據(jù)。

2.2痛風性關節(jié)炎(gouty arthritis,GA) 痛風是由于嘌呤代謝紊亂，尿酸鹽在關節(jié)囊、囊、軟骨、骨、腎皮下等組織內(nèi)沉積而引起的一種疾病，容易發(fā)生疾病和炎癥，多見于跖趾關節(jié)、踝關節(jié)等，多見于中老年男性。運用質(zhì)譜技術尋找差異性標志物，并分析標志物的相關代謝通路，去探究痛風性關節(jié)炎的發(fā)病機制。運用UHPLC-Q-TOF / MS技術并結合多變量分析方法對AGA模型大鼠的血漿的生物標志物進行分析，確定AGA的內(nèi)源性代謝物，探尋AGA的發(fā)病機制，為疾病的預防，檢測和診斷提供可靠的依據(jù)[9]。陳嬌等運用GC-MS的代謝組學方法對痛風患者的血清代謝進行分析發(fā)現(xiàn)痛風病人的血清代謝譜與健康人的血清譜存在差異[10]。而于棟華等使用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜方法對痛風性關節(jié)炎的腎臟進行代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)?；撬岷蛠喤；撬岽x，乙醛酸和二羧酸代謝與腎臟代謝有關，且?；撬岷筒菟崾瞧渖婕暗膬?nèi)源性生物標志物[11]。張寧等利用超高液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-TOF-MS)研究了總皂苷對急性疼痛的干預作用，確定了風濕性關節(jié)炎的7種潛在生物標志物包括麥角鈣化醇、軟骨素、甘油磷酰膽堿、乙二 酸、廿二碳六烯酸、?；撬岷图琢u戊酸[12]。

2.3系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE) SLE是一種典型的自身免疫性結締組織疾病，發(fā)病機制復雜，臨床癥狀多樣，給SLE的診斷和監(jiān)測帶來挑戰(zhàn)，代謝組學作為后基因新興的組學技術，為尋找新的生物標志物提供新策略和新思路。采用2-DE和MS檢測小鼠HL-60細胞的蛋白表達發(fā)現(xiàn)早期用熱休克蛋白60和α-烯醇化酶等6種細胞質(zhì)和核蛋白激活B細胞自身抗原相應的SLE自身抗體數(shù)量也會增加，這為SLE患者的發(fā)病機制提供了一定的依據(jù)[13]。王燕妮等運用質(zhì)譜方法發(fā)現(xiàn)鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶可能是新的系統(tǒng)性紅斑狼瘡候選抗原[14]。俞穎等通過液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿樣本進行代謝指紋圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)SLE的患者與健康者代謝指紋存在明顯差異，并發(fā)現(xiàn)SLE的血清當中的氨基酸、磷脂和卜啉呈高上調(diào)的趨勢[15]。Yan R采用GC-MS發(fā)現(xiàn)SLE患者糞便代謝產(chǎn)物與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指標密切相關[16]。ZhangQ采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對SLE患者和健康對照者(HCS)的血清進行代謝譜分析，該研究表明血清代謝譜在SLE患者和HCS患者中是不同的，L-焦谷氨酸升高是SLE的一個有希望的雙模式標志物[17]。

2.4類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis ,RA) RA是一種慢性非化膿性炎癥疾病，屬于自身免疫性疾病，常好發(fā)于手關節(jié)、膝關節(jié)、趾骨間關節(jié)[18]。目前，診斷RA主要靠臨床免疫學檢查及相關的影像學的手段，而疾病的發(fā)生往往最開始是功能及分子標志物的改變，繼而才是形態(tài)學的改變。運用蛋白質(zhì)組學的方法對RA的研究尋找參與發(fā)病機制的生物標志物，這為臨床上診斷RA有著重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，運用MALDI-TOF- MS技術對于RA濕熱瘀阻證、非濕熱瘀阻證及健康志愿者的血清進行檢測，篩選出其特異的生物學標志物并研究了發(fā)病機制[19]。Ran Noh等采用MALDI-TOF-MS技術，對RA患者血清及關節(jié)液進行分析，推測STEAP4和ZNF658可作為RA的特異性蛋白質(zhì)，有一定的診斷意義[20]。在類風濕性關節(jié)炎寒熱證候基因表達譜的研究發(fā)現(xiàn)：3-氧-丙酸、L-脯氨酸、尿素、5-氧-脯氨酸、核糖醇、纖維醇為在熱證中呈高表達，L-亮氨酸在寒證中呈高表達[21]。利用代組學方法對類風濕關節(jié)炎兔血漿代謝物進行影響，發(fā)現(xiàn)有尿苷、肌酸酐呈上升趨勢，壬二酸和苯甲酰氨基酯呈下降趨勢[22]。用串聯(lián)質(zhì)譜法對活動期RA患者血漿中DMARD代謝物濃度，發(fā)現(xiàn)攜帶rs1476413SNP、TT或CT等位基因的患者的血漿多谷氨酸代謝產(chǎn)物顯著升高，相應的疾病活動性評分也相應升高[23]。采用iTRAQ聯(lián)合Nano LC-MS/MS技術篩選出早期RA患者的差異的蛋白，并分析了差異蛋白主要的細胞定位、分子功能及參與的生物學過程、主要信號通路，再進一步分析這些差異蛋白相關通路，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與早期RA的發(fā)病機制密切相關[24]。運用GC-MS技術研究了蛇葡萄(AA)提取物對大鼠膠原性關節(jié)炎的代謝影響，發(fā)現(xiàn)了AA治療類風濕關節(jié)炎的20個特異性生物標志物和3個相關代謝途徑，為代謝組學生物標志物在類風濕關節(jié)炎的確認和驗證提供了新的視角[25]。Blaschke S等采用凝膠電泳(2D-DGE)分離和質(zhì)譜(MS)研究法并Western blot分析驗證法首次確定和驗證了結合珠蛋白-α1、-α2、，維生素D結合蛋白和載脂蛋白C-Ⅲ作為類風濕關節(jié)炎預測依那西普藥物療效的潛在生物標志物[26]。

2.5強直性脊柱炎(ankylosing spondylits,AS) AS是主要影響骶髂關節(jié)、脊柱和四肢大關節(jié)的慢性炎性疾病，以髖關節(jié)受累為主，嚴重會導致畸型。運用該技術尋找高靈敏和特異的AS生物標志物,為臨床上早期診療AS提供幫助。研究發(fā)現(xiàn)AS患者與健康者的代謝產(chǎn)物存在差異及不同性別之間也有一定的差別，發(fā)現(xiàn)脂類和烷烴為AS糞便的主要特征，大部分與AS患者的疾病有關，并發(fā)現(xiàn)了葡萄糖酸和α-l-半乳呋喃糖苷在AS患者腸道中的含量增加，推測與AS患者血糖升高有關[27]。Jing利用MS發(fā)現(xiàn)AS患者血清中結合珠蛋白前體表達上調(diào)，其抗原決定因子與HLA-B2705 (HLA-B27亞組)相關，推測AS的發(fā)病機制也可能與結合珠蛋白的前提有關[28]。Gao等采用氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜/質(zhì)譜(LC-MS)技術和代謝組學方法對AS患者血漿代謝產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)患者血漿中脯氨酸、葡萄糖、磷酸鹽、尿素、甘油、苯丙氨酸、同型半胱氨酸濃度升高，磷酸、色氨酸二肽-苯丙氨酸濃度降低[29]。而在動物實驗研究中，發(fā)現(xiàn)艾灸能改善AS小鼠的整體健康模型，可降低其爪子厚度和組織中IL-1β、PGE水平、IL-6和TNF-α在AS小鼠中的表達及發(fā)現(xiàn)艾灸對TCA循環(huán)、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、腸道菌群代謝和嘌呤代謝表達有逆轉(zhuǎn)作用，能夠進一步了解艾灸治療AS的機制[30]。

2.6干燥綜合征(Sjogren,s syndrome,SS) SS皮炎屬于一種自身機體免疫系統(tǒng)疾病，以直接侵犯外分泌腺組織為主，常見的表現(xiàn)在發(fā)熱口干，腮腺下部腫大，眼睛酸澀痛等多種臨床表現(xiàn)，有時也甚至可直接累及多個神經(jīng)器官。Kageyama G等用GC-MS分析原發(fā)性干燥綜合征(PSS)患者與健康者(HCS)的唾液，發(fā)現(xiàn)PSS患者唾液代謝物多樣性降低，甘氨酸、酪氨酸、尿酸和巖藻糖的含量相對減少，據(jù)此推測引起唾液腺破壞的原因有可能是由于慢性涎腺炎引起的[31]。

綜上所述，代謝組學的質(zhì)譜技術憑借其特有的優(yōu)勢，在風濕性常見疾病的生物標志物的研究當中具有很重要的意義，通過對其相關的生物標志物研究可以發(fā)現(xiàn)參與其發(fā)病機制的微生物，對疾病的早期診斷、預測及治療提供了相關依據(jù)。

3 展 望

患者血清本身抗體的形成是風濕病的主要表現(xiàn)，特異抗體和具有標志性的生物標識對疾病診斷起著舉足輕重的作用。雖然質(zhì)譜技術目前還處于發(fā)展的階段，但質(zhì)譜技術是一種新的技術手段，對尋找潛在生物標志物有著重要意義，它可以顯示疾病發(fā)生的機制，用于早期疾病診斷，實現(xiàn)靶向性治療，此外還可以用來評估治療效果和判斷預后。該技術將在未來臨床診斷中發(fā)揮重要作用，具有巨大的發(fā)展空間和前景。未來隨著質(zhì)譜技術的不斷發(fā)展成熟，將會在風濕免疫學疾病中廣泛開展研究，必將帶動風濕病學新的發(fā)展。