尹 琳 黃從新

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢大學(xué)心血管病研究所，心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：1727415874@qq.com)

【提要】 超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子(HCN)通道為超極化激活的陽(yáng)離子通道，受電壓和環(huán)核苷酸雙重調(diào)節(jié)。近期科學(xué)家利用低溫電磁儀探索了HCN通道的某些特殊結(jié)構(gòu)，為研究相關(guān)的離子通道特性提供了理論依據(jù)。HCN通道及其亞型在心臟中的分布具有一定的種屬特異性，病理狀態(tài)下各亞型的異常分布常常引起各類(lèi)心律失常，另外HCN基因突變亦參與病態(tài)竇房結(jié)的形成。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞作為一種新興的具有潛在發(fā)展前景的干細(xì)胞，將為研究HCN基因突變及其參與心臟離子通道病變的病理生理和分子學(xué)變化提供良好的模型，且有利于針對(duì)HCN通道的特異性藥物和生物起搏器的研發(fā)。

超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN)通道主要有以下特點(diǎn):超極化激活、鈉鉀離子混合通道、電壓及環(huán)核苷酸雙重調(diào)節(jié)。目前，研究表明HCN基因參與心血管系統(tǒng)的心率調(diào)節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元興奮的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)就HCN通道在心血管系統(tǒng)中作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HCN通道的結(jié)構(gòu)

HCN通道包含4種亞型(HCN1、HCN2、HCN3和HCN4)，每個(gè)通道是由4個(gè)子單位圍繞中央孔隙排列形成的1個(gè)四聚體，其中每個(gè)子單位內(nèi)主要包括S1～S6的跨膜核心區(qū)域、位于胞質(zhì)內(nèi)的氨基端與羧基端3個(gè)部分。另外，羧基末端包含有環(huán)核苷酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(cyclic nucleotide-binding domain,CNBD)。最近，有學(xué)者利用低溫電磁儀探索了HCN通道中的某些特殊結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步闡釋了該通道的某些基本特性[1-3]：(1)不同于經(jīng)典構(gòu)象的4個(gè)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)，HCN通道中編碼的鉀離子選擇性過(guò)濾器為非經(jīng)典構(gòu)象，僅包含兩個(gè)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)；另外，該鉀離子選擇性過(guò)濾器被酪氨酸所包圍，僅允許兩個(gè)鉀離子通過(guò)。當(dāng)HCN通道僅結(jié)合1個(gè)鉀離子時(shí)，鈉離子可輕易地采用非結(jié)合的方式通過(guò)該通道，進(jìn)而產(chǎn)生內(nèi)向電流。正常情況下，HCN通道的鈉鉀離子通透性的比值在1 ∶5～1 ∶3之間，且其通透比取決于細(xì)胞外的鉀離子濃度。(2)跨膜蛋白S4、S5、S6呈螺旋狀排列，其中S4螺旋的長(zhǎng)度尤其明顯，可延伸至胞質(zhì)中的CNBD段。靜息情況下，上述結(jié)構(gòu)使得去極化電壓傳感器及門(mén)控通道均處于封閉狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞膜超極化時(shí)，電壓驅(qū)動(dòng)S4螺旋向下移位，打破了跨膜蛋白之間的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此S6螺旋自發(fā)地發(fā)生旋轉(zhuǎn)，離子門(mén)控通道被打開(kāi)。而Gross等[4]利用線性方程理論，更詳細(xì)地闡述了環(huán)磷酸腺苷(cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate,cAMP)結(jié)合如何在長(zhǎng)距離上機(jī)械耦合以促進(jìn)依賴電壓的HCN通道的開(kāi)放。(3)HCN通道中存在著一段高度保守的結(jié)構(gòu)域，命名為HCND(HCN-domain)[5]。HCND段夾在電壓感應(yīng)區(qū)域和CNBD之間，并通過(guò)分子內(nèi)部相互作用在電壓感應(yīng)區(qū)域和CNBD之間搭建起1個(gè)機(jī)械連續(xù)體，即電壓感應(yīng)區(qū)域和CNBD之間變構(gòu)信息的相互傳遞可以直接通過(guò)HCND進(jìn)行，從而有利于平衡電壓及cAMP對(duì)HCN通道的雙重調(diào)控。

2 HCN在心血管系統(tǒng)中的表達(dá)

竇房結(jié)中HCN及其各分型的轉(zhuǎn)錄水平在各種屬之間具有較為明顯的差異：在小鼠、兔子和人類(lèi)的竇房結(jié)中以HCN4為主，其次為HCN1，HCN2表達(dá)量少，幾乎檢測(cè)不到HCN3[6-9]；但在犬科動(dòng)物的竇房結(jié)中，HCN4與HCN2占主導(dǎo)地位；更令人驚訝的是在整個(gè)大鼠的生命周期中，HCN2在竇房結(jié)中的轉(zhuǎn)錄水平占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)含量約為HCN4的8倍，幾乎檢測(cè)不到HCN1與HCN3的表達(dá)[10-11]。

但是，各種屬心臟的總體HCN表達(dá)具有很多的相似點(diǎn)：首先，HCN總mRNA在心臟中的分布較為一致，竇房結(jié)最高，其次依次為房室結(jié)、浦肯野纖維，而在心室與心房中表達(dá)量較少，以心房最甚[6]；其次，成年后HCN總轉(zhuǎn)錄水平隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降，但各房室中的比例基本上保持穩(wěn)定[11]；再次，4種HCN在竇房結(jié)外的分布在各種屬之間的差異性不明顯，其中心房均以HCN1為主，而HCN2則主要出現(xiàn)于心室，其轉(zhuǎn)錄水平為HCN4的5～13倍，房室結(jié)和浦肯野纖維以HCN4與HCN1為主，且兩者轉(zhuǎn)錄水平相近[6]；最后，HCN3目前未在出生后任何種屬的心臟中被檢測(cè)到，有相關(guān)研究報(bào)告其僅在小鼠早期胚胎發(fā)育階段(孕齡9.5～15.5 d)的靜脈竇區(qū)域可被檢測(cè)到[7]。

在病理情況下心臟中HCN的分布發(fā)生明顯改變。例如，充血性心力衰竭時(shí)竇房結(jié)中HCN的mRNA和蛋白質(zhì)水平均降低，但在右心房中HCN4的表達(dá)上調(diào)至基線水平的2倍[10]。另外，在病態(tài)竇房結(jié)合并房性心動(dòng)過(guò)速的犬模型中，竇房結(jié)中的HCN2、HCN4表達(dá)均明顯降低，伴If電流振幅與頻率降低，但其房性心動(dòng)過(guò)速可能是由于HCN4與HCN2在心房中表達(dá)增加所引起的[12]。還有研究表明，心力衰竭時(shí)心室肌中HCN2的表達(dá)急劇上升，其能增加β受體阻滯劑的副作用，進(jìn)而導(dǎo)致致死性心律失常[13]。

3 心血管系統(tǒng)中HCN通道的藥理學(xué)研究

3.1 特效的減慢心率制劑 特效的減慢心率制劑(specific bradycardic agent,SBA)包括烯丙尼定、扎替雷定、西洛雷定、伊伐布雷定和ZD7288，其主要作用機(jī)制是通過(guò)抑制If電流，進(jìn)而降低舒張期自動(dòng)去極化，最終達(dá)到減慢心率的目的[14]。這些藥物的一個(gè)重要特點(diǎn)是，其僅影響HCN通道的電流，而不調(diào)節(jié)該通道的電壓依賴性。烯丙尼定和扎替雷定由于其嚴(yán)重的副作用，目前均已停產(chǎn)。

伊伐布雷定是目前唯一還流通于商業(yè)市場(chǎng)上的SBA，相較于其他SBA而言，其效應(yīng)不作用于神經(jīng)系統(tǒng)，因此無(wú)明顯相關(guān)的不良反應(yīng)。新近研究表明，對(duì)于β受體阻滯劑不能控制病情的急性心力衰竭患者，聯(lián)合使用伊伐布雷定至出院，并維持使用至出院后180 d，能明顯減慢患者的心率，而不影響β受體阻滯劑的療效[15]。另有研究顯示，伊伐布雷定不僅能降低心臟移植術(shù)患者的心率，維持其左心室射血分?jǐn)?shù)，還可提高5年生存率[16]。臨床大樣本研究顯示，盡管伊伐布雷定能維持心肌梗死患者的左心室收縮功能，降低心率，但進(jìn)一步的長(zhǎng)期隨訪卻提示其可增加心血管不良事件的發(fā)生率，如心動(dòng)過(guò)緩、新發(fā)房顫等[17-19]。因此，根據(jù)歐洲心臟協(xié)會(huì)制定的指南，伊伐布雷定被認(rèn)定為收縮性心力衰竭和慢性穩(wěn)定型心絞痛患者的B類(lèi)治療藥物，其適用于最大β受體阻滯劑劑量治療下心率仍>70次/min的患者[20-21]。

3.2 選擇性HCN亞型抑制劑 近期發(fā)現(xiàn)的HCN亞型特異性抑制劑，如EC18、MEL57A，分別有選擇性地作用于HCN4通道和HCN1通道。其中，EC18能特異性靶向作用于豬竇房結(jié)細(xì)胞中的HCN4通道，而MEL57A對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)中的HCN1通道表現(xiàn)出了顯著的抑制效應(yīng)[22-23]。另外，在狗的浦肯野纖維細(xì)胞中，EC18能減少I(mǎi)f電流去極化的振幅與斜率，而MEL57A則對(duì)HCN4無(wú)明顯作用[24]。

3.3 CNBD別構(gòu)調(diào)節(jié)劑 Akimoto等[25]利用冷凍電子顯微鏡技術(shù)展示了在apo(即未結(jié)合cAMP狀態(tài)下)的HCN4通道內(nèi)CNBD的結(jié)構(gòu)。他們進(jìn)一步說(shuō)明了HCN通道自身的平衡狀態(tài)與cAMP相結(jié)合狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化及動(dòng)力學(xué)變化，其證實(shí)了帶有apo HCN4 CNBD結(jié)構(gòu)的二聚體可別構(gòu)調(diào)節(jié)HCN4通道與cAMP之間的結(jié)合，因此認(rèn)為這種別構(gòu)調(diào)節(jié)劑可作為HCN通道的新型靶向抑制劑。

目前的研究表明，伊伐布雷定應(yīng)用于心血管疾病時(shí)，仍可與其他離子通道相互作用而產(chǎn)生某些副作用。與靶向離子通道的藥物相比，靶向CNBD的別構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以提供更具有選擇特異性的HCN調(diào)節(jié)。事實(shí)上，藥物靶向變構(gòu)位點(diǎn)可能表現(xiàn)出較高的選擇性。目前，對(duì)于這種別構(gòu)調(diào)節(jié)劑作用的認(rèn)識(shí)還處于初步假設(shè)階段，仍有待進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)。

4 HCN基因突變與病態(tài)竇房結(jié)綜合征

目前，許多研究表明HCN4基因的突變參與病態(tài)竇房結(jié)綜合征的形成。例如，Ishikawa等[26]檢測(cè)到人類(lèi)HCN4基因中編碼S4電壓門(mén)控通道的區(qū)域存在突變位點(diǎn)(R393H)，與心臟鈉通道基因突變引起的病態(tài)竇房結(jié)不同，攜帶該突變的患者心電圖不表現(xiàn)為心動(dòng)過(guò)緩、房室傳導(dǎo)阻滯、心房撲動(dòng)等，外源性起搏器的植入率亦不高，其主要的臨床表現(xiàn)為心房顫動(dòng)和左心室致密化不全。HCN4基因G1097W突變體現(xiàn)為房室傳導(dǎo)阻滯及反射性竇性心動(dòng)過(guò)速，而D553N位點(diǎn)的錯(cuò)義突變導(dǎo)致HCN4通道蛋白不能被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，心電圖以長(zhǎng)QT間期與尖端扭轉(zhuǎn)性室速為主要表現(xiàn)[27-28]。

體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)HCN4參與胚胎期竇房結(jié)的發(fā)育與出生后竇性心律的維持。例如，心臟特異性敲除HCN4基因的胚胎期小鼠是不能存活的，其大約在孕齡9.5～11.5 d的階段出現(xiàn)胚胎致死性，而該階段正是正常竇房結(jié)胚胎期的發(fā)育時(shí)間，因此可認(rèn)為該胚胎致死性可能是由于竇房結(jié)未發(fā)育而造成的[29-30]。另外，在成年小鼠中，心臟特異性或全身性敲除HCN4基因或其中的某個(gè)表達(dá)位點(diǎn)(如573X位點(diǎn))后，可檢測(cè)到If電流振幅減少，體表心電圖表現(xiàn)為反復(fù)地心臟停搏或竇性心動(dòng)過(guò)緩[9,31-32]。

5 HCN通道應(yīng)用于生物起搏

生物起搏就是體外利用基因重組的技術(shù)誘導(dǎo)起搏樣細(xì)胞的形成，從而替代原來(lái)受損的起搏細(xì)胞，以使得病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者重新獲得能夠滿足正常生命活動(dòng)所需的心率。由于HCN4通道在心臟竇房結(jié)的心率調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，因此近些年來(lái)HCN通道被廣泛應(yīng)用于生物起搏的實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中。由于HCN2通道比HCN4通道更容易激活，因此研究者傾向于選擇HCN2作為生物起搏開(kāi)發(fā)的起搏基因。前期的研究是通過(guò)直接將攜帶HCN2的腺病毒直接轉(zhuǎn)染至犬的左心房或左束支，結(jié)果顯示該注射位點(diǎn)確實(shí)能在一定程度上產(chǎn)生異位起搏點(diǎn)，但其起搏心率不高，未曾達(dá)到基礎(chǔ)心率狀態(tài)[33]。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HCN4活性與心肌細(xì)胞的鈣調(diào)節(jié)有關(guān)，If電流升高會(huì)導(dǎo)致鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)，使得心室肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)HCN4，從而引起細(xì)胞死亡和心臟重塑，最終導(dǎo)致心臟擴(kuò)張和心臟功能受損[34]。

為了減少腺病毒直接作用于心臟細(xì)胞引起的免疫原性及HCN基因?qū)π募〖?xì)胞的直接損傷作用，有學(xué)者將攜帶HCN2或者HCN4的腺病毒結(jié)合相關(guān)竇房結(jié)轉(zhuǎn)錄因子如TBX3，直接在體外感染各種類(lèi)型的干細(xì)胞誘導(dǎo)起搏樣細(xì)胞，如大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞和人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)，結(jié)果顯示，相較于單純轉(zhuǎn)染TBX3而言，TBX3聯(lián)合HCN4或HCN2能明顯增加體外誘導(dǎo)的起搏樣細(xì)胞的搏動(dòng)頻率[35-37]。

6 小結(jié)與展望

隨著科學(xué)技術(shù)的日新月異及學(xué)科之間的交叉融合，研究者對(duì)HCN4通道蛋白的結(jié)構(gòu)功能與分子機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。盡管伊伐布雷定已經(jīng)被作為收縮性心力衰竭和慢性穩(wěn)定型心絞痛患者的B類(lèi)治療藥物，但特異性靶向HCN通道某些區(qū)域的別構(gòu)調(diào)節(jié)劑將有望成為新型HCN通道抑制劑。

人類(lèi)胚胎干細(xì)胞和早期心臟祖細(xì)胞高轉(zhuǎn)錄HCN4與HCN1的mRNA，在這些細(xì)胞中均可檢測(cè)到If電流的存在[38-39]。近幾年，iPSC憑借著來(lái)源簡(jiǎn)單、近乎全項(xiàng)分化潛能、低免疫原性等優(yōu)勢(shì)，逐漸占據(jù)了干細(xì)胞基礎(chǔ)研究的主導(dǎo)市場(chǎng)。目前，已在小鼠來(lái)源的多能干細(xì)胞和人 iPSC來(lái)源的心肌細(xì)胞中檢測(cè)到HCN通道的表達(dá)[40]。盡管iPSC的功能及特性尚未被完全了解，但其已成為一種新興的具有潛在發(fā)展前景的干細(xì)胞。心力衰竭和心律失常等病理狀態(tài)下HCN通道在心臟中異常分布亦為心源性猝死的病因之一，因此我們可利用干細(xì)胞建立相關(guān)病理模型來(lái)深入進(jìn)行機(jī)制學(xué)探討及藥理學(xué)開(kāi)發(fā)。此外，許多研究表明HCN基因突變?yōu)椴B(tài)竇房結(jié)綜合征的病因?qū)W之一，利用干細(xì)胞全面探討HCN通道及其突變的病理生理學(xué)變化和分子學(xué)變化過(guò)程，將有利于生物起搏器的進(jìn)一步研發(fā)。