靳雅麗，楊德智，楊世穎，張麗，呂揚

(北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院藥物研究所藥物晶型研究中心，晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

納米技術在生物醫(yī)藥領域已獲得廣泛的關注，目前，納米藥物可分為兩類：納米顆粒藥物，即藥物本身納米化，也就是采用一定手段將藥物制成納米尺寸，如混懸劑、片劑、膠囊劑等；納米載體藥物，即將藥物載入納米載體中，借助納米載體的效應更好地發(fā)揮療效，如脂質體、納米球、納米囊等[1]。與傳統(tǒng)藥物比較，納米藥物具有很多優(yōu)勢：可以改變藥物性質，增加難溶藥物溶解度；降低藥物循環(huán)過程中的降解；將藥物富集于預定作用部位，在增強藥效的同時降低副作用[2]；此外，納米載體在藥物遞送系統(tǒng)的運用可以減弱或消除生物屏障對藥物作用的限制，為疾病診斷和治療及疾病進展監(jiān)測提供新的技術方法[3-4]。

許多納米藥物正處于向臨床應用轉化的階段，全球市場趨勢表明該領域在未來幾年將強勁增長[5]。納米藥物向臨床的轉化和隨后的商業(yè)化需要建立新的分析標準或對現(xiàn)有標準進行修正，以確保此類產品的安全性和有效性[5]。另一方面，納米載體是復雜的系統(tǒng)，其制劑的物理化學性質決定其治療功效和安全性[6]。國際藥品監(jiān)管計劃的成員[5，7-8]對納米藥物分析標椎已達成共識，認為應包括粒度分布(particle size distribution，PSD)、形貌、化學組成、包封率或載藥量和藥物釋放動力學等理化參數(shù)，同時認為這些質量參數(shù)是評估納米藥物制劑的質量及臨床療效和安全性的關鍵因素。當前已有多種標準化方法來表征納米藥物關鍵的理化性質及其對醫(yī)用納米顆粒生物系統(tǒng)的影響，但遺憾的是通常不適用于復雜和創(chuàng)新納米制劑[5]，監(jiān)管機構需要建立一套標準操作規(guī)程來指導納米藥物的分析檢測，因此，有必要綜述當前納米藥物分析方法，以提高納米藥物質量分析的整體水平。目前，對納米藥物的分析集中在結構和性質的表征，筆者在本文對其粒度及PSD、形貌、包封率或載藥量分析方法進行簡單闡述外，還介紹幾種特殊的納米藥物分析方法。

1 粒度及粒度分布分析

粒度及PSD測定是納米藥物表征的最重要技術之一，掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)[9-11]用于納米藥物的表面分析和尺寸測量，是測量粒徑、PSD、聚集程度、分散性的有效方法。與SEM相比，透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)[9-11]具有更高的分辨率，是納米藥物表征不可缺少的工具。除此之外，動態(tài)光散射技術(dynamic light scattering，DLS)[12]是應用最廣泛的測量粒度分布的分析方法，具有簡便、快速、重復性強等優(yōu)點，主要用來觀測納米粒子的尺寸和表面電荷，但是分辨率低，不適合測量非球形的、混雜且不均勻的粒子，檢測結果會受環(huán)境中塵土以及樣品中聚集粒子的影響。DLS能夠對一些基于蛋白、多糖脂質體的納米材料進行表征，同時也常應用于一些合成的聚合物納米材料和于懸浮液中納米顆粒的粒徑表征[12]。王秋月等[13]采用DLS 快速、準確地完成靶向四氧化三鐵磁性納米藥物載體的表征。此外，分析性超速離心(analytical ultracentrifugation，AUC)可以高精度地研究粒徑分布，其獨特功能在于無需進行復雜的樣品制備即可分析出準確的粒徑數(shù)據(jù)，在納米藥物產品開發(fā)和質量控制方面有廣闊的應用前景[14]。

由于尺寸測量方法的固有局限性，納米顆粒多元分散體的PSD評估是一項艱巨的任務[15]。納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)、可調電阻脈沖感測(tunable resistive pulse sensing，TRPS)和非對稱流場流分離結合多角度光散射(asymmetric flow field flow fractionation-multi-angle light scatter，AF4-MALS)可以解析納米顆粒多元樣品的粒徑分布[15-17]。

隨著納米技術在醫(yī)藥領域的應用越來越廣泛，納米藥物也趨于復雜化。每種測量方式都有其優(yōu)勢和劣勢，沒有一種技術能夠測量在所有條件下的粒徑分布。所以，CAPUTO等[18]建立一種低分辨率結合高分辨率方法測量PSD和穩(wěn)定性的正交測量方法：首先用簡單快速的分析方法來確定樣品的完整性；接著結合兩種或多種高分辨率的分析方法來觀察顆粒的形狀和結構以及最終測量顆粒濃度；而當納米藥物處于復雜的生物介質中時，由于納米藥物和生物介質均不同，納米藥物的安全有效性也會變化大，所以建議采用更高分辨率的分析方法。CAPUTO等[19]采用非對稱流場流分離技術結合多角度光散射和動態(tài)光散射技術(asymmetric flow field flow fractionation-multiangle light scattering-dynamic light scattering，AF4-MALS-DLS)，用于表征基于脂質體納米顆粒的理化性質，結果顯示該技術能夠以高分辨率測量脂質體的PSD，準確反映制造過程中所引起的批次間差異和血漿中蛋白質引起的PSD變化，避免DLS分析可能導致的結果誤差。該技術在合成優(yōu)化、質量控制和監(jiān)測有機納米顆粒系統(tǒng)穩(wěn)定性上具有優(yōu)勢。

納米疫苗的粒徑和性狀對其療效起著重要的作用，KLEIN等[6]通過DLS和非對稱流場流分離技術結合紫外檢測器和多角度光散射技術(asymmetric flow field flow fractionation-UV-vis detector-multiangle light scattering，AF4-UV-MALS)對納米疫苗進行分析，結果顯示DLS可以作為中試生產工廠的質量控制技術。而AF4在測定粒度、PSD的同時還能確定納米顆粒的形狀變化及對游離活性成分進行定量分析。通過DLS和AF4-UV-MALS方法得到的批次間差異低于20%，表明此方法具有很高的可重復性。

納米藥物尺寸會影響藥物的體內分布、細胞攝取，進而影響療效，一般來說，納米藥物粒徑越小溶解性越好。但是，太小的粒徑尺寸也是不可取的。若納米顆粒太小，制備的難度大大增加，也不利于對納米藥物進行表征；若顆粒太大，容易沉淀且分散不均勻，難以被細胞攝取。所以要根據(jù)具體的情況來選擇合適的粒徑大小，例如根據(jù)腫瘤細胞與健康細胞的特點，抗腫瘤納米藥物的最佳尺寸可能是50 nm，但是仍有待進一步的研究[20]。

2 形貌成像分析

微粒形貌成像分析是表征納米材料的另一個重要的技術指標，常用方法有電子顯微鏡，包括TEM、SEM和原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)等[12]。例如，TEM已被用于不同條件下的乳蛋白納米管、血清白蛋白納米粒子以及淀粉基納米粒子的成像表征[12]。AFM是一種方便、準確、快速的技術，在納米級別生物樣品的成像分析方面很有潛力，可以用來分析粒徑大小，尤其可以用來測量納米材料的表面厚度[12]。BORCAN等[21]使用SEM來確定聚氨酯納米載體(polyurethane，PU)樣品的結構特征，使用小角中子散射法(small angle neutron scattering，SANS)確定PU微粒的紋理屬性。SANS提供樣品體積中納米級孔徑特征信息，尤其是有關PU基質-孔界面的信息。

X射線散射是一種結構表征的工具，它在實時和真實的樣品環(huán)境下實時檢測材料的能力非常獨特，研究人員可以使用互補的小角度X射線散射(small angle X-ray scattering，SAXS)和廣角X射線散射(wide angle X-ray scattering，WAXS)了解納米和埃米尺度粒子的形貌[22]。除此之外，同步輻射X射線納米成像技術能夠提供圖像數(shù)據(jù)，利用X 射線成像技術可以無損地得到納米顆粒團聚體三維結構信息，可以直觀而有效地反映樣品的形貌信息[23]。

納米藥物顆粒的形貌會影響藥物在體內的循環(huán)、分布、細胞攝取和釋放，表面粗糙的納米顆粒更易被細胞攝取，主要是因為納米級粗糙程度會降低粒子與細胞膜的排斥作用[24]。

3 包封率或載藥量分析

納米藥物分析的另一個主要參數(shù)是通過測定游離或者結合的藥物含量以計算包封率或載藥量?？偹幬锖康臏y定通?；趯{米藥物的破壞，如采用冷凍干燥和加入表面活性劑或有機溶劑等，再使用高效液相色譜(HPLC)和適當?shù)臋z測器(紫外可見或熒光)對藥物或活性成分進行定量[5]。對不同的納米藥物來說，采用的HPLC方法也不同。

通常，測量方法首先通過分離步驟：微柱離心、濾膜法、超濾、超速離心、固相萃取、分子排阻、AF4和液相色譜法等，然后再采用多種檢測技術：紫外-可見光譜、熒光、氣溶膠檢測器、質譜等進行分析[5，25-26]。例如，魏曼等[25]采用微柱離心-HPLC法測定脂質體納米粒的包封率，結果顯示該方法具有較好的適用性，能準確測定包封率。ZHANG等[26]開發(fā)一種測定納米囊包封率的簡便方法，先通過分離步驟：超濾、透析或離心，再采用蛋白定量分析試劑盒測定包封率，結果顯示該方法可以快速、準確地測定納米囊的包封率。這類方法的缺點在于過濾裝置或離心管可能會吸附被測物質，稀釋時可能會引起藥物釋放，導致測量結果有誤差。測定包封率可以采用直接法或間接法，前者直接測定納米粒的藥物含量，后者通過測定游離藥物含量間接計算包封率。采用直接法測定結果可能會受雜質干擾。而間接法通過測定游離藥物的量避免了脂質成分的影響，不必進行復雜的樣品前處理。這兩種方法各有優(yōu)缺點，要根據(jù)藥物的性質以及分離方法的特點選擇合適的分析方法。例如，若分離純化過程導致游離藥物被稀釋而難以測定則選用直接法。

除此之外，有的分析方法可以不采取前處理的方法直接測定包封率，例如微分極譜脈沖法[27]、微分掃描量熱法[28]以及顯微鏡法[29]。此類方法具有快速、簡便的優(yōu)點，但是其精密度不如傳統(tǒng)方法，結果分析也比傳統(tǒng)方法復雜，應用局限性比較大。但是，針對不同類型的創(chuàng)新型納米藥物特點，科研人員需要開發(fā)出更加便捷、準確的包封率測定方法與技術。

4 其他納米藥物分析方法

隨著納米藥物研究的不斷深入，為了達到更好的臨床療效，制備獲得的納米藥物種類更加復雜，利用智能納米藥物治療疾病成為藥學領域的熱點，許多創(chuàng)新型納米藥物、復雜納米藥物需要特殊的分析方法來對其進行表征。

4.11H-NMR 測定PEG接枝率 為了防止納米藥物剛進入人體就被免疫細胞吞噬或者被蛋白質非特異性吸附，經常在納米顆粒表面接枝聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，對于此類藥物來說接枝率可以反映納米藥物質量的優(yōu)劣[30]。然而，由于缺乏可行的表征方法，導致很多體內研究并未表征PEG在納米顆粒上的接枝密度，這使得研究結果難以評估[31]。

LU等[31]采用多洛倫茲分裂算法將游離PEG的NMR信號與接枝的NMR信號區(qū)分開，從而可以使用1H-NMR對接枝過程進行原位監(jiān)測。該方法的優(yōu)點是不受PEG末端官能團類型、表面化學性質、納米粒子或組成的限制，它還為體內生物學和生物醫(yī)學研究提供表征納米顆粒上PEG接枝密度的關鍵和標準指南。

4.2同步輻射技術分析納米藥物分布 由于高分子納米藥物的細胞吸收是納米醫(yī)學領域的熱門話題，因此如何檢測細胞中納米藥物的技術在研究其治療作用方面起著關鍵作用。PASCOLO等[32]采用基于同步輻射的傅里葉變換紅外光譜(synchrotron radiation-based fourier transform infrared spectroscopy，SR-FTIR)和基于同步輻射的X射線熒光顯微鏡(synchrotron radiation-based X-ray fluorescence，SR-XRF)研究體外聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic Acid)，PLGA]納米粒子與細胞間的相互作用，結果顯示，SR-FTIR和SR-XRF技術可能是追蹤PLGA 納米粒子在細胞內蹤跡的有力工具。

4.3熒光成像技術檢測納米載體 納米顆粒作為載體可以有效透過皮膚上皮角質層這一優(yōu)勢可應用于治療皮膚病。研究納米載體對藥物滲透性的影響，需要使用可有效分析形態(tài)、藥物載體、運輸過程的分析工具。ALEXIEV等[4]采用熒光壽命成像顯微鏡(fluorescence lifetime imaging microscopy，F(xiàn)LIM)研究皮膚組織與納米載體的相互作用。結果表明，F(xiàn)LIM可以區(qū)分目標分子和熒光標記的納米載體，在自體熒光組織的背景下，也提供局部納米顆粒的環(huán)境及其與其他生物分子的相互作用。因此，F(xiàn)LIM顯示了優(yōu)于其他基于強度顯微技術的優(yōu)勢。

5 結束語

納米藥物所具有的優(yōu)越特性預示著其在臨床疾病治療中具有十分廣泛的應用前景，隨著研究的不斷深入，也為疾病治療提供新的方法和思路。同時，必然伴隨著分析方法的不斷完善，甚至理念創(chuàng)新，由此出現(xiàn)許多高精度、高靈敏度的納米藥物分析方法，例如多種方法聯(lián)用測量PSD、細胞內納米藥物分析、同步輻射技術應用于納米分析技術等。但是納米藥物的快速研究與開發(fā)，使納米制劑更加復雜，必將給藥學人員帶來巨大的研究機遇，納米藥物體內、體外的實時在線分析檢測、對創(chuàng)新納米載體的表征及采用多種方法聯(lián)用實現(xiàn)納米藥物快速便捷的分析檢測是未來藥學人員面臨的挑戰(zhàn)。此外，隨著工程納米材料在科學技術中的快速發(fā)展和大量應用，必須仔細考慮其對環(huán)境、健康和安全的影響[33]，也需要建立合適的分析方法來對其進行監(jiān)測。