陳越亞，陳衛(wèi)昌

（蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006）

結直腸癌（colorectal cancer, CRC）是世界上第四大最致命癌癥，約占全世界每年確診癌癥和癌癥相關死亡人數(shù)的10%[1]。由我國國家癌癥中心公布的最新數(shù)據(jù)顯示[2]，2015年中國CRC新發(fā)病例共38.76萬 例，占全部惡性腫瘤發(fā)病病例的9.87%；由CRC導致的死亡病例共18.71萬 例，占全部惡性腫瘤死亡病例的8.01%。CRC的發(fā)生大多由腺瘤發(fā)展而來，這一般需要10～15 年的時間，早期診斷及干預可明顯降低CRC的發(fā)病率及死亡率[3]。因此，在無癥狀人群中篩查CRC是很重要的，同時在治療后對CRC患者病情進行監(jiān)測也是至關重要的。現(xiàn)在迫切需要研究出更強有力的早期篩查和檢測生物標志物，以促進對這一常見惡性腫瘤的更準確的早期診斷和監(jiān)測。

目前，CRC篩查方法分為侵入性及非侵入性方法兩類。侵入性方法如結腸鏡檢查，結腸鏡檢查聯(lián)合活檢病理是診斷CRC的金標準[4-5]。Brenner等[6]在2015年進行的一項薈萃分析顯示，結腸鏡檢查可將CRC的發(fā)病率降低69%，死亡率降低68%。然而，結腸鏡檢查需要徹底的腸道準備，此外，操作引起的不適和隱私的侵犯導致患者依從性差以及較高的檢查成本也導致結腸鏡檢查不適合在人群中普及。非侵入方法包括糞便隱血試驗（fecal occult blood test, FOBT）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、CA19-9等檢測等更容易被人們所接受。FOBT檢測主要包括愈創(chuàng)木脂法（guaiac fecal occult blood test, gFOBT）和免疫化學法（fecal immunochemical test, FIT）兩種檢測方式。兩種檢測方式相比，F(xiàn)IT對低濃度血紅蛋白更敏感，在CRC診斷中敏感性和特異性更高，此外，F(xiàn)IT結果不受糞便中的其他成分的影響，包括藥物及飲食因素[7]。因此，與gFOBT相比，F(xiàn)IT能夠提高受試者的依從性，并確保得到更可靠的結果。但是，F(xiàn)IT在近端結腸中的敏感性低于遠端結腸及直腸[8]，而且人們對處理糞便樣本的厭惡心理一定程度上限制了糞便檢測的普及。CEA及CA19-9是目前使用的基于血液的腫瘤標志物，可用于CRC診斷和監(jiān)測治療后反應，但靈敏度和特異性較低，這使得它們不適合作為CRC的篩查或診斷標志物[9]。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，越來越多的關于CRC的分子生物標志物被發(fā)現(xiàn)與研究[10]。CRC的發(fā)生是由于表觀遺傳變化的積累而來，這種遺傳表觀變化包括DNA甲基化、組蛋白修飾和通過非編碼RNA調控轉錄后基因，這些表觀遺傳機制的干擾可能導致癌癥的發(fā)生和發(fā)展[11]。發(fā)現(xiàn)體液表觀遺傳改變是生物標志物檢測的一種創(chuàng)新替代方法，具有穩(wěn)定性好，敏感性高，無創(chuàng)性等優(yōu)點[12]。在所有研究的表觀遺傳生物標志物中，DNA甲基化是各種癌癥中最常見的檢測方法，其中包括CRC[13]。近年來，在CRC組織、血液和糞便樣本中檢測到的甲基化DNA生物標志物得到了越來越多的研究。其中，SEPT9基因甲基化檢測被認為是CRC早期的一個特定的生物標志物。因此SEPT9基因甲基化可能是在高危人群中篩查CRC的可靠指標[14]。本文就外周血SEPT9基因甲基化檢測在CRC中的研究進展作一綜述。

1 SEPT9基因在CRC中的致病機制

Septins是一類具有GTPas活性的保守基因家族[15]，目前已發(fā)現(xiàn)14 個Septin基因，分別命名為SEPT1-SEPT14。SEPT9基因屬于其家族中的一員，位于染色體17q25.3，參與細胞分裂、細胞骨架形成、細胞自噬等生物學過程[16-17]。SEPT9蛋白是第四細胞骨架的組成部分，在活性細胞分裂過程中可聚集形成纖維微絲和其他復合物。此外，它還招募目標蛋白并穩(wěn)定胞質分裂[18]。SEPT9基因的5'端具有胞嘧啶-硫酸鹽-鳥嘌呤位點（cytosinephosphate-guanine, CpG），它是DNA甲基化的主要位點[14]。當SEPT9基因甲基化后，其編碼的蛋白復合物結構失去穩(wěn)定，使細胞分裂過程紊亂，細胞基因組不穩(wěn)定，最終導致組織癌變[19]。

DNA甲基化水平主要表現(xiàn)為非啟動子區(qū)域的低DNA甲基化水平和基因啟動子區(qū)域的高甲基化水平[20]。低DNA甲基化與轉錄激活有關，導致致癌基因表達增加，基因印跡喪失，染色體不穩(wěn)定性增加。相比之下，高DNA甲基化與基因表達沉默和基因組不穩(wěn)定性有關；減少了腫瘤抑制基因和DNA修復基因的表達；以及影響了正常細胞功能，如凋亡、DNA修復和細胞周期調節(jié)[18]。SEPT9是一種腫瘤抑制基因，已被證明在各種腫瘤中甲基化。在檢測不同類型結腸病變及其鄰近位點的SEPT9基因甲基化狀態(tài)時，Wasserkort等[21]證明了SEPT9基因的主要高甲基化發(fā)生在CRC和腺瘤上皮細胞中的V2轉錄本的CpG島3中。SEPT9基因的CpG位點高度甲基化會阻斷其基因表達并導致其抗癌功能的喪失。這種DNA甲基化以兩種方式抑制基因表達，促進腫瘤的發(fā)生。一方面，DNA甲基化改變了其構象，使其不被轉錄因子轉錄，最終抑制基因的表達[21]，另一方面，甲基化DNA分子招募和結合甲基化的CpG結合結構域蛋白。由于這些甲基化的CpG結合結構域蛋白繼續(xù)結合其他蛋白（如組蛋白去乙?；福罱K形成致密而不活躍的異常染色質，從而抑制基因表達[18]。自噬是一種調節(jié)性的細胞機制，其通過減少氧化應激，消除癌基因蛋白，維持基因組穩(wěn)定性來阻止細胞的惡性轉化，從而發(fā)揮其抑癌作用[22]。研究[23]表明，細胞自噬抑制CRC的發(fā)生。SEPT蛋白復合物參與細胞自噬[17,23-24]。甲基化SEPT9基因可抑制SEPT9蛋白表達，降低細胞自噬功能，從而促進CRC的發(fā)生和發(fā)展。

2 SEPT9基因甲基化檢測在CRC診斷中的應用

2.1 SEPT9基因甲基化檢測方法 以血液為基礎的SEPT9基因甲基化檢測旨在檢測SEPT9基因V2轉錄本啟動子區(qū)域的異常甲基化[25]。該方法的發(fā)展是基于甲基化的SEPT9基因從壞死和凋亡的CRC細胞釋放到外周血液循環(huán)中，并能應用多重實時熒光定量多聚酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）將其在外周血中檢出，在CRC輔助診斷方面展示了較高的靈敏度和特異度[26]?；谘獫{中SEPT9基因啟動子甲基化引起的表觀遺傳沉默，Epigenomics AG公司[27]在2008年首先利用歐洲可用的SEPT9生物標志物對SEPT9甲基化進行了研究，并推出了第一代有CE標示的Epi proColon實時PCR試劑盒。2016年4月，F(xiàn)DA批準Epi proColon作為50～75 歲平均風險人群的首個基于血液的CRC篩查試驗[28]。此外，隨著后續(xù)研究中的不斷改進，特別是在應用第二代Epi proColon 2.0實時PCR試劑盒后，SEPT9基因甲基化檢測靈敏度從48.2%～73.3%[28-31]提高到71.0%～95.6%[32-35]，特異度從80.0%～91.5%提高到84.8%～98.9%?，F(xiàn)在，外周血SEPT9基因甲基化檢測因其特異性高、敏感性高、患者依從性高等優(yōu)點，在我國CRC篩查、診斷、預后、復發(fā)監(jiān)測中得到了廣泛的應用[18]。

2.2 SEPT9基因甲基化檢測在CRC篩查中的作用 在一種疾病的早期診斷中應用一種檢測方法通常意味著這種檢測方法可作為該疾病的驗證性診斷或“金標準”診斷的補充或輔助方法，并可用于提高該疾病早期診斷率或陽性檢出率。檢測方法在篩查中的應用是指該檢測可以獨立地在基于人群的篩查活動中識別某些疾病的高危個體，而在篩查后通常需要進行確認性診斷[25]。SEPT9基因甲基化不僅可以發(fā)生在CRC中，還發(fā)生在其他惡性腫瘤中。Grützmann等[36]比較了SEPT9基因在各種惡性腫瘤患者外周血中的甲基化狀態(tài)。研究顯示，CRC患者的SEPT9甲基化陽性率為72%（90/125），而非CRC患者的陽性率僅為11.5%（11/96），這證實了SEPT9基因甲基化可作為CRC一個高特異性診斷標志物[36]。在CRC篩查過程中，篩查方法的高特異性有利于排除非癌樣本，避免不必要的結腸鏡檢查。

2.3 SEPT9基因甲基化檢測在CRC診斷中的算法選擇 由于SEPT9檢測是為了在未發(fā)生甲基化的SEPT9 DNA的強背景下檢測微量甲基化SEPT9的基因拷貝，而可檢測到的甲基化的SEPT9 DNA拷貝數(shù)可低至7.8 pg/mL，因此大多數(shù)研究都進行了多次PCR反應以提高SEPT9基因甲基化檢測的靈敏度[25]。目前有關SEPT9基因甲基化檢測的研究總共包括四種算法：Septin9(1/3)算法（三個PCR重復中，至少有一個檢測結果顯示陽性）、Septin9(1/2)算法（兩個PCR重復中，至少有一個檢測結果為陽性）、Septin9(2/3)算法（三個PCR重復中，至少有兩個檢測結果為陽性）、Septin9(1/1)算法（僅有一個PCR重復，且檢測結果顯示陽性），不同算法會影響SEPT9基因甲基化檢測結果的靈敏性和特異性[38]。算法的選擇是基于檢測的具體需要。如果優(yōu)先考慮排除健康陰性人群，例如在早期檢測試驗中用于診斷目的，則應使用特異性最高的算法，然而，如果優(yōu)先考慮的是識別盡可能多的真實患者以提高疾病檢出率，例如在篩查試驗中，應使用靈敏度最高的算法。篩查試驗中的高假陽性率問題可以通過進一步的診斷檢查來解決，而診斷試驗中的高漏診率可以通過常規(guī)的篩查方案來避免。Song等[25]比較了四種算法的敏感性和特異性，研究顯示，在CRC診斷中，SEPT9基因甲基化檢測采用Septin9(1/3)算法表現(xiàn)出最佳的靈敏度，而SEPT9基因甲基化檢測采用Septin9(2/3)算法表現(xiàn)出最佳的特異度。Septin9(1/3)算法或Septin9(2/3)算法的選擇取決于研究的目的。

2.4 SEPT9基因甲基化檢測在CRC癌前病變中的應用 對于SEPT9基因甲基化檢測對CRC癌前病變的篩查，有研究[35]顯示，在腺瘤中的敏感性為11%～19%，特異性為85%～94%；在息肉中的敏感性為3%～8%，特異性為90%～97%。在腺瘤和息肉中的敏感性都很低，這表明SEPT9基因甲基化檢測對CRC癌前病變的診斷價值有限。但是，另有研究[37]表明，外周血SEPT9基因甲基化檢測在高危腺瘤和多發(fā)小息肉中敏感性分別為21.6%及20.0%。這是SEPT9基因甲基化檢測在CRC診斷中的重要擴展，因為檢測CRC癌前病變可對其進行早期干預和清除，這可以降低CRC的發(fā)生率和死亡率。

2.5 SEPT9基因甲基化檢測在CRC臨床分期中的應用 雖然SEPT9基因甲基化檢測在診斷CRC中具有較高的敏感性和特異性，但檢測早期CRC的能力比檢測晚期CRC更為重要，因為在早期診斷CRC后可以實施早期干預，以提高治愈率和降低死亡率。Jin等[33]研究表示，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CRC患者中，外周血SEPT9基因甲基化檢測采用Septin9(2/3)算法陽性率分別為66.7%、82.6%、84.1%和100%，表明SEPT9基因甲基化檢測在早期CRC中有一定的檢出率，可為CRC早期診斷提供依據(jù)。外周血SEPT9基因甲基化檢測的陽性率隨著CRC的進展而增加，這可能與隨著原發(fā)性腫瘤細胞壞死和凋亡的增加引起釋放到外周血中的SEPT9基因DNA的增加有關。

3 SEPT9基因甲基化檢測在CRC治療中的應用

3.1 SEPT9基因甲基化檢測在CRC術后監(jiān)測中的應用大多數(shù)早期CRC患者進行了手術治療，以切除原發(fā)性病變和區(qū)域轉移淋巴結[38]。然而，盡管根治性切除術切除徹底，仍有30%～50%的患者將面臨CRC復發(fā)并死于腫瘤轉移[39]。進行CRC復發(fā)或轉移的術后監(jiān)測，并通過及時治療可延長患者生存時間。定期進行CT檢查及CEA檢測是監(jiān)測CRC復發(fā)最常見的兩種方法[40]。然而，CT掃描對小病變（直徑＜1 cm）的敏感性有限，并且具有較高的假陽性率[41-42]。CEA檢測是目前唯一被推薦用于常規(guī)監(jiān)測CRC復發(fā)的基于血液檢測的方法，但其敏感性和特異性仍欠佳[9]。因此，迫切需要開發(fā)新的敏感生物標志物來監(jiān)測CRC的復發(fā)或轉移。

外周血SEPT9基因甲基化檢測除了在CRC的早期診斷和篩查中應用外，已經(jīng)顯示出了評價CRC療效和監(jiān)測CRC復發(fā)的潛力。在一項研究中，9 例接受根治性手術的CRC患者分別檢測了術前及術后的外周血SEPT9基因甲基化水平。結果顯示，在術后平均118 d時，有8 例患者SEPT9基因甲基化檢測結果轉陰，同時CRC復發(fā)的患者SEPT9基因甲基化檢測結果恢復陽性。此外，SEPT9基因甲基化檢測結果陽性的患者有發(fā)生遠處轉移的傾向，并且無病生存率（disease-free survival, DFS）較低，并與SEPT9基因甲基化水平成負相關[43]。雖然該研究的樣本量很小，但它表明外周血中的SEPT9基因甲基化具有作為CRC術后復發(fā)監(jiān)測指標的潛力與價值。

3.2 SEPT9基因甲基化檢測在CRC預后中的應用SEPT9基因甲基化檢測也顯示出了在CRC中預測生存率的潛力。Shen等[44]進行了一項系統(tǒng)回顧和Meta分析研究，結果證明了SEPT9基因甲基化檢測結果陽性的CRC患者癌癥預后更差，總生存率（overall survival, OS）更低（HR＝2.07，95%CI：1.40～3.06），提示SEPT9基因甲基化檢測結果陽性的癌癥患者與檢測結果陰性的癌癥患者相比，OS降低的風險將增加2倍。其次，術前外周血中檢測到SEPT9基因甲基化檢測結果陽性的CRC患者的OS較差（HR＝3.25，95%CI：1.93～5.48），這項研究結果意味著SEPT9基因甲基化檢測是評價患者CRC預后的一種方便而有前途的方法。

4 SEPT9基因甲基化檢測與其他CRC檢測方法的聯(lián)合應用

進行多種檢測標記物或方法的聯(lián)合應用已成為CRC診斷和篩查的一種發(fā)展趨勢。Jin等[33]的研究表明，SEPT9基因甲基化檢測單獨檢測CRC的敏感性為76.8%，F(xiàn)IT單獨檢測CRC的敏感性為58.0%，而SEPT9基因甲基化檢測和FIT聯(lián)合檢測CRC的敏感性為94.2%，特異性為92.6%。此研究表明，SEPT9基因甲基化檢測和FIT檢測方法的聯(lián)合應用與它們?nèi)我粏为殭z測CRC相比，顯著提高了CRC檢測的靈敏度。Wu等[34]最近進行的一項研究表明，SEPT9基因甲基化檢測聯(lián)合FIT對CRC檢測的敏感性為94.4%，SEPT9基因甲基化檢測、FIT和CEA三項聯(lián)合檢測CRC的靈敏性為97.2%，而SEPT9基因甲基化檢測單獨檢測CRC的敏感性僅為76.6%。此外，除上述檢測方法外，SEPT9基因甲基化檢測還可以與其他現(xiàn)有的CRC檢測生物標志物聯(lián)合應用，如糖蛋白標記物或其他甲基化標記物[37]。由T?nzer等[45]發(fā)表的一項研究表明甲基化的SEPT9和ALX4的聯(lián)合檢測在結直腸息肉的檢測中具有重要意義，其靈敏度和特異性分別達到71%和95%。另一項研究[46]發(fā)現(xiàn)，SEPT9基因甲基化檢測和FIT聯(lián)合檢測晚期腺瘤的敏感性為67.6%，特異性為47.4%，而SEPT9基因甲基化檢測單獨檢測晚期腺瘤時的敏感性僅為10.8%，這提示SEPT9基因甲基化檢測和FIT兩項檢測方法的聯(lián)合應用可以提高晚期腺瘤的陽性檢出率。這些研究表明了聯(lián)合檢測在檢測結直腸晚期癌前病變中的潛在應用價值。然而，尚需要進一步的研究來評估生物標志物的聯(lián)合檢測對CRC檢測和篩查的應用價值。

5 結語

外周血SEPT9基因甲基化檢測在CRC診斷和篩查中敏感性及特異性較高，目前有關外周血SEPT9基因甲基化檢測的四種算法中，Septin9(1/3)算法靈敏性最高，Septin9(2/3)算法特異性最高?？筛鶕?jù)研究的目的進行周血SEPT9基因甲基化檢測的算法選擇，滿足實際檢測需求。SEPT9基因甲基化檢測在診斷癌前病變、術后復發(fā)監(jiān)測和預后評價方面有一定應用潛力，尚需大量臨床數(shù)據(jù)加以驗證。