鄒雨蕓，陳正榮

（1.蘇州大學(xué)兒科臨床學(xué)院，江蘇 蘇州 215025；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215025）

社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia, CAP）仍然是引發(fā)全世界死亡率和發(fā)病率的一個(gè)重要原因，特別是在老年人和5 歲以下兒童這些免疫力低下的人群中[1]。在住院病人中，CAP的死亡率可上升至10%，在需要機(jī)械通氣和延長(zhǎng)住院時(shí)間的重癥監(jiān)護(hù)病房病人中，CAP的死亡率可超過(guò)30%。在所有CAP的病原體中，非典型呼吸道病原體，如肺炎支原體正日益被認(rèn)為是呼吸道感染最重要的病原體，尤其是兒童呼吸道感染[2]。在一項(xiàng)涉及亞洲12個(gè)醫(yī)療中心的多中心研究中，超過(guò)23%的CAP病例中發(fā)現(xiàn)非典型呼吸道病原體。肺炎支原體在所有CAP病例中約12%檢測(cè)到，是分離的最常見(jiàn)的非典型病原體[3]。

在兒科人群中，肺炎支原體占所有下呼吸道感染的10%～40%[3-4]。肺炎支原體感染多發(fā)生在門(mén)診。然而，它也是因肺炎住院的一個(gè)重要原因，特別是在老年人和兒童等免疫功能低下的患者中[5]。肺炎支原體感染的表現(xiàn)可以從自限性上呼吸道疾病到嚴(yán)重肺炎。5 歲以下的兒童通常會(huì)出現(xiàn)輕微的上呼吸道癥狀，而較大的兒童和青少年則會(huì)出現(xiàn)支氣管肺炎，需要住院治療。

肺炎支原體屬于柔膜體綱支原體科支原體屬，是細(xì)胞壁缺乏的最小的自我復(fù)制生物體，能夠無(wú)細(xì)胞生存。肺炎支原體的絲狀體尖端有特殊結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)中可見(jiàn)透明腔中圍繞著一個(gè)濃厚的核狀中心，該核狀中心為黏附于宿主呼吸道上皮細(xì)胞的結(jié)合點(diǎn)。尖端結(jié)構(gòu)目前被認(rèn)為是肺炎支原體與宿主相互作用的最主要結(jié)構(gòu)。肺炎支原體侵入呼吸道后，借滑行運(yùn)動(dòng)定位于纖毛氈的隱窩內(nèi)，以其尖端特殊結(jié)構(gòu)牢固地黏附于上皮細(xì)胞表面的受體上，能抵抗黏膜纖毛的清除和吞噬細(xì)胞的吞噬，繼而產(chǎn)生一系列的細(xì)胞毒性作用[6]。肺炎支原體的基因組很小，大約為80萬(wàn)堿基對(duì)，這是其有限的生物合成能力和緩慢的復(fù)制速率的原因[7]。因此，研究肺炎支原體的致病作用的一個(gè)主要障礙是缺乏對(duì)其生物學(xué)特性的知識(shí)，這是由于培養(yǎng)肺炎支原體存在一定的困難。

在過(guò)去的幾年里，研究人員利用分子方法詳細(xì)研究了與肺炎支原體相關(guān)的潛在致病因素，他們研究了不同的發(fā)病機(jī)制，如肺炎支原體的復(fù)雜黏附機(jī)制，社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征（communityacquired respiratory distress syndrome, CARDS）毒素激活炎癥小體和肺外并發(fā)癥的發(fā)生等等。肺炎支原體感染誘導(dǎo)炎癥途徑主要有以下四種通路：(1)TLR2識(shí)別脂蛋白；(2)介導(dǎo)自噬信號(hào)；(3)炎癥小體的激活；(4)黏附特性。其中CARDS毒素在肺炎支原體的炎癥小體激活的步驟中發(fā)揮著很重要的作用。這篇綜述將試圖回顧肺炎支原體的發(fā)病機(jī)制，簡(jiǎn)單闡述CARDS毒素與呼吸道疾病發(fā)生的聯(lián)系，著重突出CARDS毒素在肺炎支原體致病作用方面的進(jìn)展。

1 CARDS毒素來(lái)源與結(jié)構(gòu)學(xué)

在20世紀(jì)70年代和80年代開(kāi)展的早期研究中，研究人員曾試圖通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)與器官培養(yǎng)來(lái)系統(tǒng)性地描述肺炎支原體感染的致病機(jī)理[8-9]。倉(cāng)鼠氣管培養(yǎng)的感染特點(diǎn)表現(xiàn)為纖毛功能喪失和胞質(zhì)空泡化。隨后胞內(nèi)空泡聚集，導(dǎo)致胞質(zhì)變形和細(xì)胞損傷[9]?；诜窝字гw感染的細(xì)胞毒性作用，研究人員猜想支原體膜相關(guān)的毒性因子可能是肺炎支原體的致病原因[10]。自由基產(chǎn)生的毒性作用只能部分解釋肺炎支原體的毒性作用[11-12]。1975年，Hu等[9]證明了在肺炎支原體感染的宿主細(xì)胞中，RNA和蛋白質(zhì)的合成受到抑制，同時(shí)代謝底物的攝取減少，這不能用機(jī)體的細(xì)胞黏附過(guò)程來(lái)解釋。因此，Hu等[9]認(rèn)為肺炎支原體對(duì)宿主細(xì)胞的主要有害影響是在DNA分子轉(zhuǎn)錄或翻譯水平。肺炎支原體感染的細(xì)胞病變效應(yīng)只有在器官培養(yǎng)中感染后24 h以?xún)?nèi)添加紅霉素才能逆轉(zhuǎn)。因此這一結(jié)論指出，機(jī)體需要合成某種蛋白質(zhì)或毒素來(lái)介導(dǎo)宿主細(xì)胞損傷[9]。隨后，Kannan等[13]在試圖表征肺炎支原體的毒力因子時(shí)觀察到鈣依賴(lài)、胰蛋白酶敏感的肺炎支原體與人體表面活性蛋白A的結(jié)合。肺炎支原體的活性蛋白A結(jié)合被發(fā)現(xiàn)是有機(jī)體在呼吸道的集群中的一個(gè)關(guān)鍵因素。肺炎支原體的蛋白需要通過(guò)親和層析法鑒定，然后進(jìn)行純化和測(cè)序。與黏附蛋白、細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白或纖維連接蛋白不同，68-kDa蛋白最初被稱(chēng)為mpn372。它的催化位點(diǎn)與百日咳桿菌毒素S1亞基具有氨基酸同源性。類(lèi)似于百日咳桿菌毒素S1亞基，mpn372蛋白被發(fā)現(xiàn)可以用來(lái)催化二磷酸腺苷核糖基化（ADP-核糖基化），并在感染細(xì)胞中具有空泡化功能[13]。通過(guò)利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和狒狒氣管的器官培養(yǎng)，Kannan和Baseman[10]證實(shí)了這種蛋白質(zhì)的毒力特性，并將其命名為CARDS毒素。

為解決原支原體肉湯培養(yǎng)中微量分離或分離量不足的問(wèn)題，Kannan等[14]在大腸桿菌中表達(dá)合成了重組CARDS毒素。用重組毒素處理倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或HEp-2細(xì)胞，結(jié)果表明重組毒素具有將煙酰胺腺嘌呤二磷酸（NAD+）中的ADP核糖基轉(zhuǎn)移到細(xì)胞蛋白氨基酸的能力。CARDS毒素的核糖化特性導(dǎo)致蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的改變，包括宿主細(xì)胞代謝途徑的酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。細(xì)胞病變表現(xiàn)為空泡化、細(xì)胞圓化和細(xì)胞變形[14]。

2 CARDS毒素在肺炎支原體發(fā)病機(jī)制

2.1 CARDS毒素導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞壞死 CARDS毒素已被證明通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中[15]。在狒狒氣管環(huán)器官培養(yǎng)中，重組CARDS毒素導(dǎo)致呼吸上皮纖毛功能喪失、胞質(zhì)大量空泡化、核固縮以及上皮完整性被破壞[16]。這些毒素介導(dǎo)的氣管環(huán)細(xì)胞毒性的進(jìn)展性變化也在一定程度上解釋了肺炎支原體呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制。CARDS毒素的空泡毒素作用與肺炎支原體感染后的組織病理改變有著重要聯(lián)系，包括氣道上皮細(xì)胞與纖毛細(xì)胞等空泡變性，進(jìn)而導(dǎo)致纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、纖毛剝脫、氣道上皮細(xì)胞壞死脫落與氣道上皮完整性缺失等改變。而胞質(zhì)中空泡的大量產(chǎn)生多來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)吞系統(tǒng)的核內(nèi)體、溶酶體等[17]。

2.2 CARDS毒素的促炎癥作用 在小鼠和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中，Kannan等[18]也針對(duì)重組CARDS毒素對(duì)呼吸道的影響進(jìn)行了研究。在鼻腔接種BALB/c的小鼠誘導(dǎo)氣道黏膜產(chǎn)生廣泛的細(xì)支氣管周?chē)装Y和血管周?chē)装Y。暴露于支氣管肺泡灌洗液后第7天，嗜酸性粒細(xì)胞顯著增加，伴有短暫中性粒細(xì)胞增多。Hardy等[19]證明，小鼠早期的細(xì)胞因子反應(yīng)主要是促炎癥反應(yīng)，包括IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α。在狒狒中，毒素接種導(dǎo)致趨化因子增加，如粒細(xì)胞集落刺激因子以及促炎細(xì)胞因子，與人類(lèi)肺炎支原體感染非常相似。因此，在動(dòng)物模型中，CARDS毒素暴露會(huì)引起呼吸道的促炎反應(yīng)。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)包含受體是細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體因子，存在于多種細(xì)胞中，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。NLRs是作為病原體相關(guān)分子模式的傳感器。最典型的NLR是髓系細(xì)胞表達(dá)的NLRP-3，在對(duì)PAMPs的反應(yīng)中上調(diào)后與炎性小體結(jié)合。這種NLRP-3炎癥復(fù)合體可以激活caspase-1，進(jìn)而導(dǎo)致IL-1β的釋放[20]。IL-1β是一種炎癥細(xì)胞因子，它通過(guò)活化的B細(xì)胞依賴(lài)途徑激活核因子輕鏈增強(qiáng)劑來(lái)放大針對(duì)感染因子的炎癥反應(yīng)[21]。CARDS毒素與NLRP-3炎性小體在體外小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞內(nèi)共定位，通過(guò)NLRP-3的ADP核糖化特性激活炎性小體，隨后釋放IL-1β[22-23]。而CARDS毒素可以通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中[15]。因此，通過(guò)細(xì)胞進(jìn)入CARDS毒素介導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞中炎癥小體的激活，可以有效釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β進(jìn)入氣道。然而，感染后炎癥小體的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致組織損傷，因?yàn)橐l(fā)氣道“過(guò)度炎癥”[20,24]。

2.3 CARDS毒素調(diào)控Th2分化作用 CARDS毒素在體內(nèi)具有高免疫原性表位，可引起嗜酸性粒細(xì)胞增多，T細(xì)胞和B細(xì)胞積聚，產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體，同時(shí)釋放各種細(xì)胞因子[25]。Medina等[26]通過(guò)對(duì)肺炎支原體感染小鼠肺泡灌洗液的定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)也證實(shí)了TH2細(xì)胞因子IL-4和IL-13和趨化因子、趨化因子配體-7和趨化因子配體-32的表達(dá)顯著增加。細(xì)胞因子的表達(dá)增加對(duì)T細(xì)胞亞群Th1/Th2比例產(chǎn)生破壞，表現(xiàn)為T(mén)h2細(xì)胞炎性反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致黏液化生、氣道高反應(yīng)性增加和肺功能下降。在Medina等[26]的實(shí)驗(yàn)中，先前小鼠曾用卵清蛋白致敏，而重組CARDS毒素暴露導(dǎo)致小鼠呼吸道Th2炎癥反應(yīng)加重。感染小鼠的侵入性肺測(cè)量結(jié)果顯示，由于氣道反應(yīng)性增加，進(jìn)而導(dǎo)致氣道阻力增加，肺順應(yīng)性降低。

3 CARDS毒素與疾病的關(guān)系

變應(yīng)原誘導(dǎo)的炎癥小體激活也導(dǎo)致肺損傷和肺重塑，這與哮喘和慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[27]。同時(shí)，CCL-17和CCL-22的趨化活性導(dǎo)致淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的聚集、IL-4和IL-13表達(dá)的增加、嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肺部炎癥和氣道反應(yīng)性的增加是人類(lèi)哮喘發(fā)病的決定性因素。CARDS毒素在小鼠和狒狒等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的呼吸道分泌物中也能產(chǎn)生類(lèi)似的細(xì)胞因子和細(xì)胞特征。這些發(fā)現(xiàn)表明了CARDS毒素在哮喘惡化中的作用，并進(jìn)一步證實(shí)了肺炎支原體感染和哮喘之間的聯(lián)系。

4 總結(jié)與展望

自從采用高靈敏度的分子分析方法以來(lái)，研究人員對(duì)這種生物體的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有所提高，并且開(kāi)始進(jìn)一步研究并描述CARDS毒素的生物特征。在炎癥小體的作用方面，研究人員對(duì)于免疫發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，它們可以作為調(diào)節(jié)疾病過(guò)程的潛在治療靶點(diǎn)，例如針對(duì)相關(guān)肽的抑制劑或抗體。然而，大多數(shù)研究都是在細(xì)胞系或動(dòng)物模型中進(jìn)行的。因此，需要對(duì)人類(lèi)亞細(xì)胞水平的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更大規(guī)模的研究來(lái)設(shè)計(jì)出能在易感人群中產(chǎn)生高水平保護(hù)性免疫的疫苗。這些研究將進(jìn)一步提高我們對(duì)肺炎支原體致病機(jī)制及其過(guò)程的了解與認(rèn)知，特別是在機(jī)體與慢性肺部疾病和肺外并發(fā)癥的關(guān)系方面。研究CARDS毒素的毒性特性可以提供新的診療模式，從而使肺炎支原體感染能夠得到全面有效的管控。