趙西太 聶青和

空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院感染病科(全軍感染病診療中心) (陜西 西安, 710038)

低病毒血癥(LLV)這一概念引入慢性乙型肝炎治療領域已十余年，相關研究逐漸增多，隨著抗病毒治療的進步，LLV在慢性乙型肝炎治療管理中的重要性更加凸顯，引起了相關領域專家們的重視。為此，2018年美國肝病研究協(xié)會(AASLD)發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南中專門給出了持續(xù)LLV的管理建議[1]。

1 LLV概述

低病毒血癥(LLV)的概念來源于艾滋病研究領域，定義為人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者血漿中持續(xù)可測但低于1 000拷貝/ml的病毒載量。多項研究發(fā)現(xiàn)[2]，接受高效聯(lián)合抗反轉錄病毒治療但出現(xiàn)LLV的HIV感染者中，隨訪中大部分病例會發(fā)生與抗反轉錄病毒治療相關的耐藥突變，且LLV與HIV病毒學進展和HIV感染者的病情進展相關。與HIV類似，乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染者體內病毒難以徹底清除。HBV慢性感染主要發(fā)生于圍生期及幼年，HBV復制過程中部分DNA可形成半衰期較長的共價閉合環(huán)狀DNA作為復制模板，加上感染過程中抗病毒相關細胞免疫功能受損，HBV在患者體內持續(xù)存在，需要長期進行抗病毒治療[3]。慢性HBV感染者接受抗病毒治療后，血清HBV DNA載量可快速下降，但在早年間，由于實驗室檢測靈敏度不足，血清HBV DNA載量檢測下限較高(1 000拷貝/ml或更高)，因此，確定HBV DNA“轉陰”的患者，其血清HBV DNA真實水平未知。近年來，HBV DNA檢測技術快速進步，可檢測到20 IU/ml或更低水平的HBV DNA，因而臨床上發(fā)現(xiàn)相當比例的乙型肝炎患者血清HBV DNA長期維持在低水平，因此有學者引入LLV的概念并加以研究。考慮到非活動性慢性乙型肝炎患者HBV DNA水平通常低于2 000 IU/ml，目前多將LLV定義為HBV DNA持續(xù)或偶爾可測到，但<2 000 IU/ml[1]。

慢性乙型肝炎LLV的定義涉及HBV DNA的定量檢測，因此檢測方法及計量單位應當力求規(guī)范、統(tǒng)一，以利于不同實驗室檢測結果之間進行比較。HBV DNA定量檢測方法較多，如實時定量PCR法和既往使用的分枝鏈DNA法、捕獲雜交法、液相雜交法和分子信標法等，檢測結果多以“拷貝/ml”為計量單位，不同檢測方法得到的結果通常無法換算、無法進行對比，不利于臨床應用[4]。WHO于1995年設立基因組擴增技術標準化國際工作組，為輸血安全領域重要血液傳播病原體的核酸檢測設定統(tǒng)一的國際標準，后來其工作范圍擴展到臨床上常見感染性疾病的診斷和監(jiān)測[5]。工作組制作待檢病原體基因組核酸標準品，供全球微生物學實驗室和檢測試劑生產商作為一級參比樣品，并規(guī)定國際單位(IU)作為參比樣品的計量單位，該計量單位來源于對第一批標準品的物質量的規(guī)定，例如，1999年制作的第一批HBV DNA凍干標準品的量規(guī)定為500 000 IU/瓶，稀釋后濃度單位通常記作IU/ml，這樣，IU/ml就可作為統(tǒng)一的衡量病原體濃度的單位，有利于不同實驗室檢測結果的直接比較。當前使用的HBV DNA標準品是2016年制作的替代品，含量為477 500 IU/ml。目前HBV DNA定量檢測多用實時定量PCR-熒光探針的方法，所用商品化試劑測得的結果通常以IU/ml標示，單位換算關系通常為1 IU/ml≈5拷貝/ml，但具體到不同試劑或有所不同，換算系數(shù)要參考試劑使用說明書。由于不同實驗室檢測HBV DNA靈敏度有所不同，為更準確地鑒定LLV，應盡可能選用檢測下限最低的實驗室檢測方法。

2 LLV的流行病學

乙型肝炎治療領域內LLV是一個比較新的概念，LLV在未治療和治療的患者中發(fā)生率尚無準確統(tǒng)計數(shù)據(jù)，但其流行強度可以從抗HBV治療效果的臨床研究中略窺一斑。重慶醫(yī)科大學主持開展的一項大型多中心隨機對照試驗(RCT)，對比替諾福韋和恩替卡韋在HBeAg陽性初治慢性乙型肝炎患者中長期抗病毒療效，隨訪至144周時，兩組中分別有91.7%(144/157)和86.7%(137/158)的患者HBV DNA低于檢測下限(20 IU/ml)[6]。北京大學人民醫(yī)院開展的一項真實世界研究(RWS)評估了恩替卡韋的長期療效，治療至60個月時，94.4%(220/233)的患者獲得病毒學應答(HBV DNA<20 IU/ml)[7]。這兩項研究中，抗病毒治療較長時間(3～5年)后，仍有5%～10%的患者未達到病毒學應答，不排除其中相當比例的LLV患者存在。

有些研究部分披露了核苷(酸)類似物治療過程中的LLV發(fā)生情況。兩項大型國際多中心RCT對比丙酚替諾福韋(TAF)和替諾福韋的抗HBV療效，隨訪至96周時，HBeAg陽性患者中TAF組和替諾福韋組HBV DNA低于檢測值下限(29 IU/ml)的比例分別為72.8%(423/581)和74.7%(218/292)，HBV DNA≥29 IU/ml且<69 IU/ml的比例分別為4.8%(28/581)和2.1%(6/292)；而HBeAg陰性患者為90.2%(257/285)和90.7%(127/140)，HBV DNA≥29 IU/ml且<69 IU/ml的比例分別為1.8%(5/285)和2.1%(3/140)[8]。該研究的數(shù)據(jù)表明，TAF和替諾福韋治療96周后，至少有3.9%的患者存在LLV。日本學者2019年發(fā)表一項多中心回顧性隊列研究，其入組患者基線資料表明，接受恩替卡韋單藥治療、核苷(酸)類似物聯(lián)合治療(拉米夫定+阿德福韋酯、拉米夫定+替諾福韋、恩替卡韋+阿德福韋酯、恩替卡韋+替諾福韋)的成年慢性乙型肝炎患者中，治療2年及以上者，明確出現(xiàn)LLV者分別占比19.9%(38/191)和7.4%(9/122)[9]。

根據(jù)現(xiàn)有臨床研究數(shù)據(jù)推測，在核苷(酸)類似物治療較長時間后，LLV仍較常見。由于我國慢性乙型肝炎患者眾多，LLV群體規(guī)?；蛳喈斁薮螅_有必要盡快厘清LLV的臨床意義，以指導慢性乙型肝炎的臨床管理。

3 LLV的臨床意義

3.1 LLV與肝纖維化進展 HBV感染是肝纖維化/肝硬化的明確的危險因素，2006年的一項研究表明，全世界范圍內的肝硬化患者中，約有30%與HBV感染有關[10,11]。HBV不直接殺傷肝細胞，而是機體對受感染的肝細胞的免疫反應引發(fā)肝細胞損傷和長期的肝臟慢性、持續(xù)的炎癥，但機體該免疫反應并不能有效清除HBV，長此以往，便可導致肝硬化[12,13]。持續(xù)性的HBV高載量是肝硬化發(fā)病較大危險因素，尤其是HBV DNA在106拷貝/ml以上者，但HBV DNA水平較低的患者仍可發(fā)生肝硬化[14,15]。

由首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院的一項前瞻性隊列研究，探索慢性乙型肝炎抗病毒治療過程中LLV與肝纖維化進展的關系，研究結果于2020年發(fā)表[16]。研究者納入379例成年慢性HBV感染初治患者，無失代償性肝病及肝臟腫瘤，其中HBeAg陽性者HBV DNA >20,000 IU/ml，HBeAg陰性者HBV DNA>2 000 IU/ml，研究期間所有患者接受恩替卡韋治療，入組時及以后每26周進行一次實驗室檢查，肝活檢于入組時及隨訪78周時各進行一次，最終有239例完成78周隨訪研究并被納入分析。結果表明，78周時約30%患者的HBV DNA未轉陰(>20 IU/ml)，HBV DNA未轉陰者有27%發(fā)生肝纖維化進展，而HBV DNA轉陰者有6%發(fā)生肝纖維化進展。對于基線Ishak評分≥3分的患者，HBV DNA未轉陰、飲酒是肝纖維化進展的獨立危險因素，比值比(odds ratio，OR)分別為4.84(1.30～17.98)、23.84(2.68～212.50)。具體分析，纖維化進展型患者的HBV DNA未轉陰率(50.0%)高于纖維化逆轉型患者(19.1%)和纖維化中間型患者(26.1%)。另外，根據(jù)Ishak評分進行的配對分析中，肝纖維化進展的19例患者中有52.6%(10/19)HBV DNA未轉陰，而肝纖維化逆轉的患者中僅有21.1%(4/19)，且多數(shù)未轉陰患者的病毒載量居于20～200 IU/ml之間?；谏鲜鼋Y果，研究者認為慢性乙型肝炎患者使用恩替卡韋治療78周時低水平的殘存HBV或可繼續(xù)促進肝纖維化進展。不過，該研究失訪率過高(36.9%，140/379)，隨訪時間較短，恐難以避免肝纖維化和抗病毒效果的長期波動性對研究結論的影響，且未明確文題中所說“低水平HBV”的具體限值。因此，對于LLV能否促進肝纖維化這一問題，該研究的結論應作慎重解釋。來自土耳其2018年發(fā)表的一項病例對照研究發(fā)現(xiàn)，年輕的慢性乙型肝炎LLV患者中有較高比例發(fā)生顯著肝纖維化[17]。研究納入了273例19～40歲、男性、HBeAg陰性、ALT升高、無其他肝病、未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者，進行肝活檢及HBV DNA等實驗室檢測，將患者分為LLV組和對照組(HBV DNA>2 000 IU/ml)進行統(tǒng)計學分析，觀察患者肝臟顯著組織學異常的情況，包括顯著壞死性炎癥和顯著肝纖維化，前者要求組織活動指數(shù)(HAI)≥4，后者為Ishak評分≥2。結果顯示，有139例患者表現(xiàn)為LLV，134例患者HBV DNA>2 000 IU/ml，其中，LLV患者的顯著炎癥性壞死和顯著肝纖維化發(fā)生率分別為44.6%(62/139)和30.2%(42/139)，而照組中兩者發(fā)生率則較高，分別為62.7%(84/134)和55.2%(74/134)。該研究表明，有肝炎活動而未經(jīng)治療的年輕男性慢性乙型肝炎患者中，即使HBV DNA載量較低，肝臟組織學病變包括顯著肝纖維化的發(fā)生率也相當高。因此，持續(xù)LLV的危害不容小覷。

除了上述活動性慢性乙型肝炎，浙江省人民醫(yī)院于2016年發(fā)表的一項研究觀察了HBeAg陰性非活動性慢性乙型肝炎患者LLV與肝臟組織病理學變化的關系[18]。研究納入了102例成年、HBeAg陰性、ALT正常、未經(jīng)治療、無其他肝病的慢性乙型肝炎LLV患者，進行血清學和肝組織學檢查。結果表明，患者隊列中發(fā)生顯著肝組織學病變的比例高達38.2%(39/102)，包括22.5%(23/102)的Metavir評分2～3級的肝纖維化和24.5%(25/102)的中重度炎癥?？梢?，非活動性慢性乙型肝炎LLV患者中也存在較高比例的顯著肝臟組織學病變。

此外，2016年發(fā)表的一項來自巴西的小樣本橫斷面研究也得出了類似結論，ALT輕度升高<2×正常值上限(ULN)的慢性乙型肝炎患者中，40.7%(11/27)表現(xiàn)出較重的肝損傷(Metavir評分>2)[19]。

綜上，無論是未經(jīng)治療的慢性乙型肝炎LLV，還是抗病毒治療過程中未達到病毒學應答導致的LLV，均可能繼續(xù)促進肝纖維化進展。近年來，瞬時彈性成像技術已成為一種成熟而較為可靠的肝纖維化無創(chuàng)診斷技術，臨床上廣泛用于診斷顯著肝纖維化、進展期肝纖維化及肝硬化[20]。因此，對于LLV患者，定期監(jiān)測，以評估是否啟動或調整抗病毒治療，是改善慢性乙型肝炎患者整體預后的必要措施。

3.2 LLV與肝細胞癌(HCC) 肝硬化是HCC的主要危險因素，在HBV相關的肝硬化患者中，高載量HBV DNA是HCC發(fā)生的獨立危險因素[1, 21]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，LLV也與HCC的發(fā)病有關系。韓國研究人員2017年報道了一項回顧性隊列研究，探討了恩替卡韋治療過程中的慢性乙型肝炎患者LLV與HCC發(fā)生的關系[22]。研究納入875例恩替卡韋單藥初治的成年慢性乙型肝炎患者，病例入組前HBV DNA≥2 000 IU/ml，且在接受恩替卡韋治療后維持HBV DNA<2 000 IU/ml，隨訪中按照HBV DNA水平將患者分為兩組，持續(xù)病毒學應答(MVR)組和LLV組，其中MVR指HBV DNA持續(xù)陰性(HBV DNA<12 IU/ml)。結果顯示，MVR組中HCC的3年和5年累計發(fā)生率分別為3.2%和7.5%，均低于LLV組的6.2%和14.3%，LLV是發(fā)生HCC的危險因素，相對于MVR的風險比為1.98(1.28～3.06)。亞組分析顯示，伴有肝硬化的MVR組和LLV組患者的5年發(fā)病率更高，分別為10.3%和23.4%，調整年齡、性別、HBeAg和基線HBV DNA水平后，LLV相對于MVR的風險比為2.20(1.34～3.60)。該研究表明，恩替卡韋治療過程中的LLV可增加HCC發(fā)病風險，尤其是在患有肝硬化的患者中。該研究團隊2015年發(fā)表的一篇論文報道了另一項回顧性隊列研究，納入了385例初治、LLV、HBV相關代償性肝硬化患者，隨訪觀察平均5.6年，發(fā)現(xiàn)LLV組患者HCC 5年發(fā)生率顯著高于HBV DNA陰性組(<12 IU/ml)，分別為10.0%和2.2%，其風險比為5.20(1.53～17.6)[23]。

LLV對HCC的影響不只在于增加發(fā)病率，還可導致HCC患者總體生存率下降。上述韓國研究團隊2019年報道了另一項回顧性隊列研究，描述了伴有LLV的HBV相關HCC患者的臨床過程[24]。研究納入565例伴有慢性乙型肝炎LLV的成年HCC患者，根據(jù)病毒學應答情況分為3組，MVR組(持續(xù)性HBV DNA<9 IU/ml)、LLV組和反跳組(至少一次HBV DNA>2 000 IU/ml)，隨訪時長4.1±2.1年。結果顯示，MVR組(187例)、LLV組(221例)和反跳組(157例)患者的5年生存率分別為74.3%、67.3%和61.7%，其中LLV組與MVR組患者5年生存率的差別統(tǒng)計學意義較弱(P=0.076)。該研究說明維持MVR有利于提高HCC患者的5年生存率，相對于MVR，LLV不利于HCC患者的5年生存率的改善。

3.3 LLV與慢性乙型肝炎再活動 非活動性慢性乙型肝炎LLV可自發(fā)或在一定條件下發(fā)生HBV再活動。2019年美國和加拿大開展了一項多中心隊列研究，觀察了HBeAg陰性慢性乙型肝炎低病毒載量患者(≤10 000 IU/ml)未治療情況下自發(fā)為活動性肝炎的情況[25]。研究納入951例HBeAg陰性的未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙型肝炎成年患者，要求HBV DNA≤10 000 IU/ml(包括HBV DNA 1 000～10 000 IU/ml且ALT<1×ULN，HBV DNA<1 000 IU/ml且ALT 1～2×ULN)，并排除失代償性肝病、肝癌、急性HBV感染等情況。平均隨訪4年，觀察病情變化，作者引入“模式轉換”這一概念作為觀察指標，定義為非活動性乙型肝炎向活動性乙型肝炎的自發(fā)轉變，具體標準為HBV DNA>10 000 IU/ml且ALT>2×ULN(ULN的男女數(shù)值分別為30 U/L和20 U/L)，或入組24周后啟動抗病毒治療。結果顯示，834例DNA DNA≤10 000 IU/ml且ALT≤2×ULN的患者納入了模式轉變分析，共有97例發(fā)生了模式轉變或啟動治療(7.6/100人年)；按HBV DNA水平進行分組，≤100 IU/ml，101～≤2 000 IU/ml和2001～≤10 000 IU/ml三個組的模式轉變或啟動治療發(fā)生密度分別為4.6/100人年、6.8/100人年和12.2/100人年，而5年累積發(fā)生率分別為9.2%、13.6%和24.2%；單純模式轉變有55例(3.6/100人年)，三個組的發(fā)病密度分別為0.8/100人年、3.7/100人年和5.9/100人年，5年累積發(fā)生率分別為2.4%、8.3%和13.3%。基線HBV DNA≤2 000 IU/ml的有634例，兩組HBV DNA≤100 IU/ml和101～≤2 000 IU/ml的模式轉變或啟動治療的5年累計發(fā)生率分別為9.7%和15.9%，而單純模式轉換的5年累計發(fā)生率分別為3.0%和10.6%。該研究中HBV DNA≤100 IU/ml和101～≤2 000 IU/ml兩個組可視為HBeAg陰性慢性乙型肝炎LLV，隨訪結果顯示，其向活動性肝炎自發(fā)轉換的幾率并不低。此類患者應當定期給予HBV DNA和生化等監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)病情變化并進行恰當干預。2014年的一篇文獻報道了來自韓國的一項回顧性隊列研究，該研究納入130例HBV相關的早期HCC患者，所有患者均接受了HCC根治性切除術治療，其中64例接受抗病毒治療，且術前HBV DNA<2 000 IU/ml，其中HBV DNA陰性(<9 IU/ml)組53例，LLV組77例，術后隨訪平均28.3個月，兩組患者HBV再激活的發(fā)生率分別為41.5%和40.3%，而HBV再激活是HCC術后復發(fā)的危險因素，其風險比為2.03(1.06～3.88)，值得注意的是，抗病毒治療可顯著降低術后HBV再激活的發(fā)生率[26]。

3.4 LLV與HBV耐藥 HBV耐藥相關突變在經(jīng)治及未治療患者中均少量存在，而抗病毒治療對HBV耐藥相關突變有篩選作用?？共《局委熯^程中，HBV耐藥常表現(xiàn)為病毒學突破。病毒學突破早期發(fā)生耐藥突變的HBV復制能力一般較為低下，但是，如果不及時調整抗病毒治療方案，HBV可能繼續(xù)發(fā)生補償性突變，而使其復制能力逐步恢復[1]?？共《局委熯^程中出現(xiàn)的LLV可能與HBV發(fā)生耐藥性突變有關，而持續(xù)LLV或可促進HBV耐藥的發(fā)生，增加病毒學突破的幾率。

2010年發(fā)表的一項關于HBV耐藥的小樣本橫斷面研究，納入64例拉米夫定或拉米夫定+阿德福韋酯治療的乙型肝炎患者，其中25例出現(xiàn)病毒學突破，血清HBV DNA濃度為12～345 IU/ml，39例HBV DNA低于檢測下限(12 IU/ml)，拉米夫定耐藥突變結果表明，22例成功進行檢測的病毒學突破患者中，17例(77.2%)為陽性，而HBV DNA<12 IU/ml的患者中12例成功進行了拉米夫定相關耐藥突變檢測，6例陽性(50%)[27]。由此可見，抗病毒治療過程中，即使病毒血癥水平極低，HBV的耐藥突變仍可出現(xiàn)。不過，LLV與HBV耐藥發(fā)生率的確切關系，持續(xù)LLV是否誘發(fā)HBV耐藥，目前尚待更有針對性和說服力的研究進行闡釋。

4 LLV的臨床管理

慢性乙型肝炎治療的病毒學應答通常定義為血清HBV DNA不可測，但此定義依賴于實驗室檢測方法的檢測值下限。當前臨床上常用的HBV DNA檢測技術的檢測值下限有100 IU/ml、20 IU/ml，部分醫(yī)療機構甚至仍使用檢測值下限為500 IU/ml的檢測技術，十分不利于LLV的檢出。HBV DNA檢測技術發(fā)展迅速，部分單位的實驗室技術除了可定量檢測低至20 IU/ml的HBV DNA，還可以給出“目標未檢出”定性結果，而微滴式數(shù)字PCR技術的引進可使HBV DNA定量檢測下限低至8拷貝/ml，獲得臨床應用后可進一步助力于檢出更多LLV[28]。

慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治療過程中出現(xiàn)LLV，后續(xù)應如何處理，目前尚無高質量研究給予指引。AASLD最新慢性乙型肝炎指南建議，接受恩替卡韋、替諾福韋、TAF單藥治療的患者出現(xiàn)持續(xù)LLV時，無論ALT是否異常，均可繼續(xù)原方案單藥治療，但相關研究證據(jù)質量很低[1]。有研究顯示，恩替卡韋單藥治療和核苷(酸)類似物聯(lián)合治療(拉米夫定+阿德福韋酯、拉米夫定+替諾福韋、恩替卡韋+阿德福韋酯、恩替卡韋+替諾福韋)2年及以上仍表現(xiàn)為LLV的43例慢性乙型肝炎患者，換用TAF治療48周后，其中40例獲得了病毒學應答(<20 IU/ml)[9]。因此，抗病毒療效不理想或出現(xiàn)持續(xù)LLV時，換用耐藥屏障更高的抗病毒藥物不失為一種有效的臨床方案。

5 討論

當前，一線強效低耐藥抗病毒藥物恩替卡韋、替諾福韋、TAF臨床應用日漸廣泛，持續(xù)病毒應答率顯著改善[29]。但臨床上LLV問題逐漸凸顯，需要引起臨床醫(yī)生足夠重視。然而，目前LLV相關研究較少，其臨床過程及分子機制尚待進一步闡釋。綜合現(xiàn)有資料分析，LLV亟待解決的問題有以下幾個：①LLV的概念需要進一步澄清，方便臨床管理和和研究；②LLV的流行病學，如在未治和經(jīng)治患者中的發(fā)生率，不同性別、年齡中的發(fā)生率；③進一步揭示LLV患者的臨床表現(xiàn)，比如肝功能異常情況，如何與非活動性HBsAg攜帶者進行區(qū)分等等；④進一步研究LLV的臨床意義，比如是否影響HBeAg血清轉換率及HBsAg的下降或陰轉，是否促進HBV耐藥，是否促進肝炎活動、肝纖維化進展和HCC發(fā)生，是否不利于乙型肝炎患者遠期生存；⑤針對LLV，如何制定更合理的抗病毒初治方案和挽救治療方案。