周進(jìn)進(jìn)，王 娟，李曉娜

(連云港市第一人民醫(yī)院兒內(nèi)科，江蘇 連云港 222000)

兒童哮喘是常見的慢性呼吸道疾病，哮喘急性發(fā)作可突然發(fā)生胸悶、咳嗽、氣促及喘息等癥狀，或原有癥狀急劇加重，并且常伴呼吸困難，以呼氣流量下降為特征，常因呼吸道感染或接觸刺激物、變應(yīng)原誘發(fā)[1-2]。兒童是哮喘的高發(fā)人群，發(fā)病率達(dá)1.5%～7.45%，且呈逐年上升趨勢[3]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A是由輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其參與了體內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[4]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1與氣道重塑有關(guān)。免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)可與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合，使氣管處于高敏狀態(tài)，再次接觸過敏原時(shí)，即可造成機(jī)體的過敏反應(yīng)。本文研究了IL-17A rs2275913基因多態(tài)性與哮喘患兒TGF-β1和IgE表達(dá)水平的臨床意義，以期為哮喘兒童的治療提供資料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)抽取2018年6月至2020年6月連云港市第一人民醫(yī)院收治的哮喘患兒45例為哮喘組，隨機(jī)選取同時(shí)期健康體檢兒童45例為對照組。對照組中男性27例(60.00%)，女性18例(40.00%)；年齡為1～5歲，平均年齡(4.21±1.06)歲。哮喘組中男性26例(57.78%)，女性19例(42.22%)，年齡為1～6歲，平均年齡(4.47±1.56)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)，且兩組兒童及家屬均簽訂知情同意書。兩組的一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷和防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的患兒[5]；②對照組兒童近期無感染、發(fā)熱等，且無過敏史和鼻炎疾病史等過敏性疾病家族史；③哮喘組患兒近期未使用過激素類藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在嚴(yán)重免疫功能缺陷；②入院前1個(gè)月內(nèi)應(yīng)用相關(guān)免疫抑制劑；③伴有先天性心臟病及呼吸道疾?。虎馨槠渌到y(tǒng)嚴(yán)重器質(zhì)性疾病。

1.3 方法

1.3.1脫氧核糖核酸的提取

采集兩組兒童空腹外周靜脈血2mL置于抗凝管中，以脫氧核糖核酸(DNA)提取試劑盒(上海生工生物有限公司)提取兩組的IL-17A rs2275913基因DNA，提取引物分別為正向：5′-GCATAACTCTT-CTGGCAGCTGTA-3′，反向：5′-TGCCCACGGTCC-AGAAATAC-3′，引物延伸序列：5′-TTTTTCCCAA-TGAGGTCATAGAAGAATCTCT-3′(上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)引物)。

1.3.2 IL-17A rs2275913基因多態(tài)性的檢測

采用15μL DNA反應(yīng)體系(2μL模板DNA、1.5μL Mg2+、1IUTaq DNA聚合酶、1.5μL 10×緩沖液(Buffer)、0.3μL脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)和1μL多重聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物，其余部分由雙蒸水補(bǔ)充至15μL檢測基因多態(tài)性。將上述試劑充分混勻，離心，置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min，在擴(kuò)增階段以95℃×3min、94℃×15s、55℃×15s、72℃×30s的程序完成35個(gè)循環(huán)。完成擴(kuò)增后，取3μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，以0.2μL ExoI和0.8μL FastAPc純化。取2μL PCR產(chǎn)物，加入1μL的多重分析試劑和1μL延伸產(chǎn)物，并加入雙蒸水至6μL，將上述混合液以96℃×1min、96℃×10s、52℃×5s的程序完成30個(gè)循環(huán)，然后60℃×30s的程序進(jìn)行延伸反應(yīng)。取延伸產(chǎn)物1μL，加入10μL的Buffer，95℃變性3min，然后冰浴，在測序儀上測序。

1.3.3 IL-17A rs2275913基因分型

采用GenMapper 4.1進(jìn)行IL-17A rs2275913基因單核苷酸多態(tài)性分型(上海生工生物有限公司幫助完成)。

1.3.4哮喘相關(guān)指示物的檢測

采集兩組兒童空腹外周靜脈血2mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測兩組的TGF-β1和IL-17A水平；采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清中IgE。檢測試劑盒均購于上海生工生物有限公司，并按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組IL-17A rs2275913基因多態(tài)性和Hardy-Weinberg遺傳平衡的情況

經(jīng)檢測，IL-17A rs2275913位點(diǎn)含有3種單核苷酸多態(tài)性，分別是野生型純合子GG型、突變型雜合子GA型、突變型純合子AA型。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證顯示，對照組、哮喘組的組內(nèi)IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)的預(yù)測與實(shí)測分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的比較[n(%)]

2.2 兩組基因型的情況

兩組兒童基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，哮喘組等位基因A頻率高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組兒童基因頻率的比較[n(%)]

2.3 兩組TGF-β1、IgE和IL-17A水平的情況

對照組TGF-β1、IgE和IL-17A水平均低于哮喘組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組兒童TGF-β1、IgE和IL-17A水平的比較

2.4 哮喘兒童不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平的情況

哮喘組患兒不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且基因型AA和GA攜帶者表達(dá)的TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于基因型GG，見表4。

表4 哮喘兒童不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平的比較

2.5 IL-17A rs2275913基因多態(tài)性與兒童哮喘的關(guān)系

以GG型基因?yàn)榛担瑢?種基因型和哮喘風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系進(jìn)行二元Logistic回歸分析顯示，基因型GA、基因型AA和等位基因A的攜帶者患哮喘的可能性是基因型GG患兒的1.831、2.431和2.146倍(P<0.05)，見表5。

表5 IL-17A rs2275913基因多態(tài)性與兒童哮喘關(guān)系的分析

3 討論

3.1 哮喘的發(fā)病機(jī)制

哮喘是由多種基因控制，且具有遺傳傾向性的呼吸道慢性疾病。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受環(huán)境、遺傳等多方面因素影響。在哮喘發(fā)病機(jī)制中，普遍被學(xué)者接受的是Th1/Th2分泌失衡學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為哮喘患者體內(nèi)Th1/Th2比例失衡，其是由于Th0細(xì)胞、Th2細(xì)胞分化增加，導(dǎo)致Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子降低，Th1細(xì)胞功能受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致患者哮喘的發(fā)生[6]。IL-17由Th17細(xì)胞分泌，具有較強(qiáng)的促炎作用，通過對樹突狀細(xì)胞的刺激作用，釋放炎性介質(zhì)，同時(shí)激活巨噬細(xì)胞等分泌炎性因子，使氣道處于高反應(yīng)狀態(tài)及氣管重塑，IL-17的分泌還可促進(jìn)IgE水平的提高。有研究發(fā)現(xiàn)，位于6p12.1基因上的IL-17A基因與自身免疫性疾病相關(guān)[7]。

3.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡與1IL-17A rs2275913基因多態(tài)性

有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A rs2275913基因多態(tài)性與兒童哮喘易感性有關(guān)[8]。本研究顯示，IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)存在3種基因型，即基因型GG、GA、AA，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證，符合基因型頻率分布，哮喘組等位基因A頻率高于對照組(P<0.05)，說明IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)等位基因A的突變可能是哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因子。

3.3 哮喘患兒不同基因型TGF-β1、IgE和IL-17A水平的分析

有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)等位基因A的突變可促進(jìn)IL-17的分泌，而IL-17水平的升高促進(jìn)了IgE分泌增加，IgE與哮喘患者氣道高反應(yīng)性呈正比[9]。TGF-β1可通過對上皮細(xì)胞的破壞和對杯狀細(xì)胞增殖的促進(jìn)，加速氣道重塑和氣管平滑肌細(xì)胞的增生。

本研究顯示，哮喘患兒IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)的等位基因A頻率高于對照組，而等位基因G頻率低于對照組(P<0.05)；哮喘組患兒AA基因型的頻率高于對照組，基因型AA和GA患兒的TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于基因型GG患兒，且哮喘組患兒TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于對照組(P<0.05)，表明IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)的等位基因A與哮喘患兒氣道高反應(yīng)狀態(tài)和炎癥因子升高有關(guān)，且等位基因G可能是哮喘患兒的保護(hù)性因子。

3.4 IL-17A rs2275913基因多態(tài)性與兒童哮喘關(guān)系的分析

本研究對3種基因型和哮喘風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系進(jìn)行二元Logistic回歸分析顯示，在以GG型基因?yàn)榛担蛐虶A、基因型AA和等位基因A的攜帶者患哮喘的可能性是基因型GG兒童的1.831、2.431和2.146倍，說明IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)的等位基因A是哮喘的易感因子，增加了患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)基因型AA和GA攜帶者表達(dá)的TGF-β1、IgE和IL-17A水平均高于基因型GG。IL-17A rs2275913基因位點(diǎn)的等位基因由G突變?yōu)锳時(shí)，增加了兒童哮喘發(fā)生率，等位基因A是哮喘的易感因子，其可作為對哮喘患者早期預(yù)防和治療的參考。