夏美艷，朱 敏，黃亞雄

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指和同一個(gè)伴侶連續(xù)2次及以上妊娠停止，其病因復(fù)雜，與環(huán)境、人為、遺傳等因素有關(guān)。RSA是妊娠期常見的并發(fā)癥，在育齡期女性中有1%～5%的發(fā)病率，且隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加[1]。有研究表明，RSA患者再次妊娠后，其自然流產(chǎn)率可達(dá)到70%～80%[2]。既往認(rèn)為子宮是無菌的，但隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中存在微生物群。有研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜存在微生物群和胎盤共生定植[3-4]。人體生理代謝不僅受控于自身基因，還受控于腸道菌群，腸道菌群的平衡與人體健康有關(guān)。腸道菌群在人體吸收和轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中起到重要作用，與胃腸道疾病、婦科疾病密切相關(guān)[5-6]。但是對(duì)于子宮內(nèi)膜微生物群及腸道菌群與RSA的相關(guān)性，目前尚無深入研究?；诖?，本文以RSA患者為研究對(duì)象，分析子宮內(nèi)膜微生物群及腸道菌群與RSA的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院因稽留流產(chǎn)行清宮術(shù)的RSA患者63例為流產(chǎn)組，選取同期因早孕要求終止妊娠行人流術(shù)的患者60例為對(duì)照組，選取同期因子宮肌瘤等行盆腔內(nèi)手術(shù)且術(shù)中未發(fā)現(xiàn)有子宮內(nèi)膜異位癥病灶的患者53例為正常組。本研究通過倫理審核，所有研究對(duì)象均知情同意，自愿參加。納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往有2次及以上自然流產(chǎn)，且夫妻雙方的染色體檢查、生殖器檢查均為正常，診斷為RSA；②育齡期女性；③身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)在18.5～23.9kg/m2(正常范圍)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、丙肝病毒(hepatitis C surface antigen，HCV)等檢查異常；②抗子宮內(nèi)膜抗體、抗精子抗體、抗心磷脂抗體均呈陰性；③近3個(gè)月內(nèi)使用過抗生素；④近3個(gè)月內(nèi)使用過避孕藥等糖皮質(zhì)激素或者性激素；⑤泌尿生殖道炎癥或者是其他感染性疾??；⑥肝炎、糖尿病或者是其他自身免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1子宮內(nèi)膜微生物群的檢測(cè)

流產(chǎn)組在清宮術(shù)后、對(duì)照組在人流術(shù)后分別取蛻膜組織分泌物，正常組在盆腔內(nèi)手術(shù)后使用臨床陰拭子蘸取子宮內(nèi)膜處分泌物，迅速將采集的樣本放置于無菌試管，-80℃保存?zhèn)錅y(cè)。采用擴(kuò)增子16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)微生物群，PCR擴(kuò)增陰道拭子樣品的16SrRNAV46保守區(qū)，將PCR終產(chǎn)物經(jīng)過Illumina NextSeq 550AR測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE100-bp測(cè)序后，得到高通量下機(jī)原始?jí)A基序列，采用QIIME分析生物信息學(xué)及測(cè)序數(shù)據(jù)，根據(jù)OUT分類進(jìn)行結(jié)果鑒定。

1.2.2腸道菌群的檢測(cè)

在手術(shù)當(dāng)天采集患者3g新鮮糞便，采用光岡法獲取1g標(biāo)本，將標(biāo)本置于厭氧菌中進(jìn)行稀釋，采用振蕩器進(jìn)行快速勻漿，再用生理鹽水逐次將標(biāo)本稀釋呈1×10-8倍，選取50μL的標(biāo)本，將其涂抹在乳桿菌和雙歧桿菌的培養(yǎng)基上，在溫度為37℃的溫箱中進(jìn)行48h培養(yǎng)，然后再進(jìn)行定性和定量處理。再選取1g的標(biāo)本，將標(biāo)本置于需氧菌中進(jìn)行稀釋，選取50μL的標(biāo)本，將其涂抹在酵母菌、腸球菌、腸桿菌的培養(yǎng)基上，在溫度為37℃的溫箱中進(jìn)行48h培養(yǎng)，然后再進(jìn)行定性和定量處理。菌落數(shù)采用lgCFU/g表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料的比較

三組的年齡、BMI、月經(jīng)周期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組一般資料的比較結(jié)果

2.2 各組子宮內(nèi)膜微生物群的比較

三組的變形菌門、異常球菌-棲熱菌門、大腸埃希菌/志賀菌屬分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；流產(chǎn)組和對(duì)照組的變形菌門分布均明顯高于正常組(χ2值分別為4.251、7.155，P<0.05)，異常球菌-棲熱菌門分布均明顯低于正常組(χ2值分別為4.634、5.965，P<0.05)，對(duì)照組的大腸埃希菌/志賀菌屬分布明顯低于正常組(χ2=7.062，P<0.05)，見表2。

表2 三組子宮內(nèi)膜微生物群分布的比較結(jié)果[n(%)]

2.3 各組腸道菌群含量的比較

三組的酵母菌、腸球菌、腸桿菌含量比較均為流產(chǎn)組>對(duì)照組>正常組，三組的乳桿菌、雙歧桿菌含量比較均為正常組>對(duì)照組>流產(chǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；流產(chǎn)組的酵母菌、腸球菌、乳桿菌、腸桿菌、雙歧桿菌含量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為8.148、3.677、7.002、3.895、11.135，P<0.05)，流產(chǎn)組的酵母菌、腸球菌、乳桿菌、腸桿菌、雙歧桿菌含量與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為13.053、11.474、9.572、8.755、12.159，P<0.05)，對(duì)照組的酵母菌、腸球菌、乳桿菌、腸桿菌、雙歧桿菌含量與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.286、8.948、2.845、7.714、5.732，P<0.05)，見表3。

表3 三組腸道菌群含量的比較結(jié)果

2.4子宮內(nèi)膜微生物群和腸道菌群與RSA的相關(guān)性分析

經(jīng)Kendall′s tau-b分析，子宮內(nèi)膜微生物群的變形菌門與RSA呈正相關(guān)(P<0.05)，異常球菌-棲熱菌門與RSA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；經(jīng)Spearman分析，腸道菌群的酵母菌、腸球菌、腸桿菌與RSA均呈正相關(guān)(P<0.05)，乳桿菌、雙歧桿菌與RSA均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 子宮內(nèi)膜微生物群及腸道菌群與RSA的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

3.1 RSA的發(fā)病機(jī)制

RSA是常見的育齡期女性疾病，隨著女性壓力的增加，其發(fā)病率也不斷升高，其中不明原因RSA的發(fā)生率也逐漸升高，可對(duì)女性身心健康造成嚴(yán)重的影響。RSA發(fā)病原因十分復(fù)雜，與環(huán)境、內(nèi)分泌、染色體異常、感染等因素有關(guān)，其中環(huán)境、父方、母體、胚胎是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要因素[7-8]。因此，明確RSA發(fā)病原因，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)早期診斷、提高有效的治療尤為重要。

3.2 子宮內(nèi)膜微生物群與RSA的相關(guān)性

既往已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在女性陰道中存在微生物，但通常認(rèn)為子宮腔是無菌器官，即胎兒是在無菌環(huán)境中長(zhǎng)大的。有研究認(rèn)為，子宮內(nèi)膜的微生物可能來源于陰道微生物上行，經(jīng)陰道放置宮內(nèi)節(jié)育器或者是采取輔助生殖技術(shù)治療，都有可能使陰道的微生物進(jìn)入到子宮[9]。很多微生物和哺乳動(dòng)物存在共生關(guān)系，微生物能夠通過宿主獲得穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，而宿主則受益于微生物對(duì)生理的重要貢獻(xiàn)。宏基因組學(xué)分析推動(dòng)了人體自然定植的研究，揭示了以前被認(rèn)為是無菌的身體部位的微生物群，這包括上生殖道和胎盤，挑戰(zhàn)了1個(gè)世紀(jì)以前提出的“無菌子宮”理念。目前，越來越多的研究認(rèn)為子宮內(nèi)膜存在細(xì)菌定植[10-11]。韓陽等[12]采用高通量測(cè)序流產(chǎn)女性子宮內(nèi)的微生物菌群顯示，自然流產(chǎn)女性變形菌門、大腸埃希菌/志賀菌屬分別為主要的優(yōu)勢(shì)菌門、菌屬，分別占92.83%、85.14%。本研究采用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)組和對(duì)照組的變形菌門分布均明顯高于正常組，異常球菌-棲熱菌門分布均明顯低于正常組，對(duì)照組的大腸埃希菌/志賀菌屬分布明顯低于正常組，說明RSA也是以變形菌門、大腸埃希菌/志賀菌屬作為主要的優(yōu)勢(shì)菌門、菌屬。本研究中Kendall′s tau-b分析顯示，子宮內(nèi)膜微生物群的變形菌門與RSA呈正相關(guān)，異常球菌-棲熱菌門與RSA呈負(fù)相關(guān)，提示子宮內(nèi)膜微生物群在RSA發(fā)病中可能發(fā)揮作用，可為RSA治療提供輔助參考。

3.3 腸道菌群與RSA相關(guān)性

腸道菌群種類和數(shù)量龐大，是人體“隱藏的器官”。有研究表明，腸道菌群的紊亂會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥，引發(fā)腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展[13]。尹瑋等[14]和李變玲等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與肥胖、糖尿病、心腦血管疾病、炎癥性腸炎、胃腸道癌癥和自身免疫性疾病等具有一定的相關(guān)性。為適應(yīng)腸道微生物群的存在，腸道菌群及其產(chǎn)生的代謝物，可以與宿主的免疫系統(tǒng)進(jìn)行相互作用，導(dǎo)致腸黏膜表面吞噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)能力及自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的殺傷能力都要低于血循環(huán)的正常免疫細(xì)胞。RSA患者蛻膜組織局部的免疫功能存在表達(dá)異常，其血液為高凝狀態(tài)，且纖溶系統(tǒng)也受到損傷[16]。妊娠期糖脂代謝的異常，不僅會(huì)造成腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的變化，還會(huì)造成嬰兒腸道菌群早期定植異常，對(duì)子代的遠(yuǎn)期發(fā)育造成影響，增加子代成年后發(fā)生慢性代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。梁惠霞等[17]研究表明，妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)患者的乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量相對(duì)較少，提示其可能在GDM的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，三組的酵母菌、腸球菌、腸桿菌含量比較：流產(chǎn)組>對(duì)照組>正常組，三組乳的乳桿菌、雙歧桿菌含量比較：正常組>對(duì)照組>流產(chǎn)組，提示在RSA中，酵母菌、腸球菌、腸桿菌總菌數(shù)數(shù)量較多，乳桿菌、雙歧桿菌總菌數(shù)數(shù)量較少，與徐廣立等[18]的研究吻合。本研究中Spearman分析顯示，腸道菌群的酵母菌、腸球菌、腸桿菌與RSA均呈正相關(guān)，乳桿菌、雙歧桿菌與RSA均呈負(fù)相關(guān)，提示RSA與腸道菌群密切相關(guān)，可能成為后期治療的靶點(diǎn)。

綜上所述，RSA患者子宮內(nèi)膜生物群偏高，腸道菌群水平均偏高，且與子宮內(nèi)膜微生物群和腸道菌群均存在相關(guān)性，可為RSA的后期治療提供輔助參考。