林錦良，陳小芳，李友鳳

(遵義師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，貴州 遵義 563002)

1 引言

酶是生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)或核酸類催化劑，不改變反應(yīng)方向和反應(yīng)平衡時，可以改變化學(xué)反應(yīng)的速度[1]。它既可以在生物體內(nèi)發(fā)生作用，也可以脫離生物體，甚至在有機溶劑中起著催化作用。而且，酶具有高效性和專一性的特點，使其催化的反應(yīng)具有效率高，副產(chǎn)物少的優(yōu)點。同時，酶的催化反應(yīng)可以發(fā)生在水溶液中、溫度適中(室溫)、pH值接近中性、離子濃度低和常壓等條件中發(fā)生，反應(yīng)條件溫和[2]。因此，酶工程被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域的研究，比如食品、制藥、環(huán)境、檢測、農(nóng)業(yè)等。近年來，隨著物質(zhì)生活的不斷改善，醫(yī)療健康引起了人們越來越多的重視[3]。在此背景下，人們開發(fā)了各種類型的藥物中間體和藥物的酶催化反應(yīng)。然而，如上所述，酶源于生物體內(nèi)，這意味著其一旦離開最佳反應(yīng)條件，優(yōu)勢將被部分抑制直至完全失效。所以，獲得耐受性強的酶和開發(fā)條件溫和的體系是推廣酶催化的藥物合成反應(yīng)在規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用中重要的途徑。

生物催化劑最主要的就是需要有高活性, 而要在生產(chǎn)實踐中運用則需要低成本[15]。自然界生物中存在豐富的酶資源，但能用于作為工業(yè)生產(chǎn)生物催化劑的不多，主要是因為酶的活性被一些工業(yè)的極端環(huán)境所限制(高溫、高壓、pH值等)，這種條件下容易失去活性。研究者為了克服這些難題，通常選擇在極端環(huán)境中生存的微生物體內(nèi)挖掘耐受極端環(huán)境的酶，比如rTaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用[4]。但此種方法局限性大，而且不易培養(yǎng)。當然基因技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上促進了新酶發(fā)掘[5]。但獲得耐受性高的酶大部分具有更強的目標性和不確定性，在實際生產(chǎn)中并未大規(guī)模應(yīng)用。因此，酶催化的合成，目前最直接的途徑是從生物體內(nèi)合成提取，這樣在獲得藥物時避免了特殊反應(yīng)條件的配備。于是也有部分合成工藝在生物體內(nèi)進行。這些途徑都極度依賴目標生物體。為了實現(xiàn)脫離生物體的酶催化反應(yīng)的條件，除了在酶的本身進行改造之外，人們不斷地模擬各種相應(yīng)生物體環(huán)境。這些反應(yīng)環(huán)境主要包括以下幾類：①水相反應(yīng)體系，②有機相反應(yīng)體系，③氣相反應(yīng)體系，④超臨界流體，⑤離子液體，⑥雙水相反應(yīng)體系。

雙水相體系是一類新型的且具有極大開發(fā)價值的酶催化反應(yīng)介質(zhì)。雙水相體系一般由兩種不同的聚合物，一種聚合物與一種親液鹽，或一種離散鹽和一種親液鹽，并在適當?shù)耐獠凯h(huán)境誘導(dǎo)下(溶質(zhì)濃度、環(huán)境溫度、光照條件、pH值等)形成[6]。雙水相體系在反應(yīng)中的優(yōu)點主要是消除產(chǎn)物抑制和催化劑的分離。前者可以促進催化過程，提高反應(yīng)速率；后者簡化了產(chǎn)物的分離過程，有效地控制了成本[7]。非離子類型的雙水相體系，具有離子強度低的特點。所用原料都是非揮發(fā)性成分，可循環(huán)利用，對操作環(huán)境造成較小影響，也被廣泛認為是典型的綠色工藝。所以該體系與傳統(tǒng)反應(yīng)分離流程中的操作相比具有顯著優(yōu)勢，是一種有效的包括藥物合成在內(nèi)的生物催化體系[8]?；陔p水相體系和酶催化的優(yōu)點，以及當前人們對新型藥物的需求，本文將選用幾種較為常見的例子進行論述。一方面，對藥物的類型上進行分類，以獲得相關(guān)的規(guī)律性，便于指導(dǎo)后續(xù)的相關(guān)研究工作；另一方面，對相關(guān)合成例子的擴展，使相關(guān)知識對運用于其它領(lǐng)域起到啟示性作用。因此，通過本文的研究，使雙水相體系中的酶催化藥物合成技術(shù)期待在更多的領(lǐng)域得到關(guān)注和應(yīng)用，促進該新型技術(shù)在產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

2 不同種類藥物的雙水相合成

2.1 抗生素類藥物的合成

2.1.1 氨芐西林

氨芐西林是廣泛應(yīng)用于臨床治療的一種抗生素，具有良好的抗菌能力和較小的毒副作用[9]。在合成氨芐西林的化學(xué)過程中，需要基團保護和去保護等苛刻條件以及產(chǎn)生毒性較大的氯等有機化合物，產(chǎn)生的廢物難以回收利用，殘留在環(huán)境中會污染環(huán)境。為了克服上述缺點，青霉素?；复呋铣砂逼S西林反應(yīng)條件溫和，有機溶劑用量少，反應(yīng)步驟簡單，是環(huán)境友好型工藝[10]。但是需要投入大量原料，往往造成大量原料浪費，生產(chǎn)成本高導(dǎo)致經(jīng)濟利潤不高，限制了大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。Andersson等利用酶催化反應(yīng)在以8.9%的聚乙二醇-2000/7.6%的磷酸鉀溶液為基礎(chǔ)的雙水相系統(tǒng)進行氨芐西林的合成，并取得95%以上的酶回收效果[11]。邵晨等根據(jù)氨芐西林和生產(chǎn)原料的溶解性特點，采用親水性離子[Bmim]BF4和鹽溶液作為反應(yīng)體系的雙水相[12]。實驗表明，該方法可以將氨芐西林的回收率提到70.79%，反應(yīng)效率也同時得到很大提升。宋肖單等在聚乙二醇(PEG-4000，w=20%)和(NH4)2SO4,w=15%)組成的雙水相體系中合成氨芐西林[10]。在該雙水相體系中反應(yīng)的產(chǎn)率達到了80%，與原水溶劑中其產(chǎn)率為27%相比具有明顯的提高。而且在連續(xù)4次的合成之后，最高達到98%的產(chǎn)率。反應(yīng)效率提高，源于產(chǎn)物溶解于上層溶液中，消除了抑制作用，化學(xué)平衡往正方向移動。此外，由于產(chǎn)物往上層聚集，也簡化了產(chǎn)物氨芐西林的分離和純化的過程。因此，采用雙水相體系催化合成氨芐西林，極大的節(jié)約生產(chǎn)成本。

2.1.2 6-氨基青霉烷酸

目前，6-氨基青霉烷酸(6-APA)的重要合成前驅(qū)體是青霉素G。青霉素G本身對敏感病原體有強大的滅殺作用且毒性低微而被廣泛使用，臨床上常為抗菌藥物的首選[13]。這種中間體抑菌能力小且可以通過引入不同側(cè)鏈來獲得許多藥效不同的青霉素。但使用青霉素酰化酶使青霉素G 裂解時發(fā)現(xiàn)，這種應(yīng)用存在產(chǎn)物抑制，并且青霉素?；覆环€(wěn)定，產(chǎn)率低下。因此，一種具有光敏性質(zhì)且可循環(huán)利用的聚合物被合成[14]。Dextran與該高聚物形成雙水相體系，該雙水相體系可用于催化青霉素G使其裂解為6-APA，可解除產(chǎn)物或者底物的抑制，使產(chǎn)率大大提高。

2.1.3 頭孢霉菌類抗生素

頭孢氨芐是一種半合成的第一代口服頭孢霉菌類抗生素藥物。該類藥物的作用機制是通過抑制菌類細胞壁的合成，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物膨脹至破裂，實現(xiàn)殺死細菌。朱建航等構(gòu)建了20%聚乙二醇400/15%硫酸鎂組成的雙水相體系，并證明該體系在酶催化合成頭孢氨芐顯示了高效的性能。頭孢氨芐在聚乙二醇上相進行富集、青霉素?；冈诹蛩徭V下相分配[15]。通過兩相之間組分的萃取，消除產(chǎn)物抑制并打破化學(xué)反應(yīng)的平衡，使反應(yīng)平衡向有利的合成反應(yīng)方向進行，最終的結(jié)果可將產(chǎn)率從單一水相的20%提高到60%左右。

頭孢丙烯也屬于一種口服頭孢霉菌類抗生素藥物，可抑制細菌細胞壁的合成，主要用于治療復(fù)發(fā)性、急性中耳等呼吸道感染。頭孢丙烯的安全性和臨床型治療使其成為一種具有競爭力的治療抗生素，但其傳統(tǒng)的合成方法及化學(xué)技術(shù)成本極高[16]。Pan等采用以7-氨基-3-(1-丙烯基)-4-頭孢菌酸母核和(R)-氨基-(4-羥基苯基)乙酸甲酯鹽酸鹽為?；w，在以丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲胺乙酯和甲基丙烯酸丁酯為原料合成的PADB和PMDB組成的雙水相體系，用固定化青霉素?；复呋铣深^孢丙烯[17]。因其組成雙水相體系的兩種共聚物有易于放大、回收率高等特點，可用于進一步地工業(yè)化生物分離。

2.1.4 6-甲基氫化可的松

甾體藥物已經(jīng)成為僅次于抗生素的第二大類藥物。在甾體藥物或其中間體的合成路線中,微生物轉(zhuǎn)化是不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過甾類藥物 A 環(huán)Δ1 脫氫可以提高藥理活性和降低副作用[20]。但是在該脫氫過程面臨著甾類底物在水溶液培養(yǎng)基中的溶解度差的問題，降低了轉(zhuǎn)化效率。當大量的反應(yīng)底底物集中在一相時，也存在不同程度的產(chǎn)物(底物)抑制[21]。孫新宇等在對PEG/Dextran雙水相體系進行選擇和優(yōu)化后甾類化合物6-甲基氫化可的松的生物轉(zhuǎn)化[22]。利用簡單節(jié)桿菌內(nèi)Δ1脫氫酶在配比為16% PEG 20000/4% Dextran 40000的雙水相體系中將6-甲基氫化可的松脫氫轉(zhuǎn)化為6-甲基潑尼松龍。雙水相體系脫氫轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)技術(shù)提高了25%～30%，并且增大了底物的投料濃度。

2.2 神經(jīng)類藥物(普瑞巴林)

普瑞巴林((S)-(+)-3-氨基甲基-5-甲基己酸)是一種親脂性物質(zhì)4-氨基丁酸(GABA)類似物，作為LyricaTM上市用于治療癲癇[18]。雖然普瑞巴林最初是用于部分癲癇的輔助治療，但最近的研究表明，它對神經(jīng)性疼痛、皰疹后神經(jīng)痛和焦慮障礙的治療有效[19]。(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)是普瑞巴林的關(guān)鍵手性中間體。Wu[14]等在研究了幾種由無機鹽和親水溶劑組成的雙水相體系從生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵液中提取(S)-CMHA的可行性后。經(jīng)過5種親水溶劑和鹽類測試中，結(jié)果表明：硫酸銨和丙酮是提取(S)-CMHA的最佳雙水相體系。在對比幾次試驗后結(jié)果表明(S)-CMHA在中性和堿性條件下更穩(wěn)定，且其(S)-CMHA的回收率高達99.15%。這些結(jié)果表明：兩步法是大規(guī)模提取(S)-CMHA的一種有前途的策略。因此雙水相體系酶催化為其提供了良好的酶促反應(yīng)分離能力，并且增大了酶與產(chǎn)物的回收效率。

2.3 氨基酸類化合物

2.3.1 2-甲基-L-色氨酸

2-甲基-L-色氨酸是抗菌素硫鏈絲菌肽合成中重要的中間體，含有2-甲基色氨酸的寡肽化合物可以使親軀體細胞釋放生長素，使動物的生長速度加快[23]。徐禮生等在水/有機溶劑雙相中，以L-絲氨酸和2-甲基吲哚為底物，利用重組大腸桿菌DM206種子液[pETDuettrpBA+trpA/BL21(DE3)]色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸，并優(yōu)化了其轉(zhuǎn)化條件[24]。通過增加體系中有機相濃度提高了酶反應(yīng)速率，大大縮減了整體的反應(yīng)時間，顯示出了綠色高效的合成方法。

2.3.2 L-苯丙氨酸

L-苯丙氨酸作為人體所需的八大氨基酸之一，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[25]。苯丙氨酸可以作為飲料添加劑，添加到食品中，還可作為一些藥物的中間體。徐虹等用兩菌雙酶法由苯丙酮酸生產(chǎn)L-苯丙氨酸[26]。孫廣海在經(jīng)過多次試驗后最終選定20%PEG 1000/16%磷酸鈉鹽為雙水相酶法轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸最佳的雙水相體系[27]。在轉(zhuǎn)氨酶的作用下大腸桿菌細胞與底物大都被分配到了上相，而產(chǎn)物 L-苯丙氨酸相當大一部分被分配到了下相。由于雙水相體系對細胞酶活力起穩(wěn)定作用，在多批次轉(zhuǎn)化中，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率相比于傳統(tǒng)水相體系的轉(zhuǎn)化率提高了27.4%。

2.4 復(fù)合凝膠微球的制備

在藥物發(fā)揮作用的過程中，除了目標分子的直接效用，輔助成分也起著重要的作用。凝膠微球在控制藥物釋放速率、包裹與封存固定化酶領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，其中在傳遞系統(tǒng)中的涉及的蛋白類分子尤為突出，因此研究也更為廣泛[28，29]。海藻酸鈣凝膠因其具有良好的生物相容性、降解性、粘附性，無毒害等特點而被廣泛應(yīng)用于此類研究[30]然面，單組分的海藻酸鈣面臨著包埋率低的問題，使它的應(yīng)用在一定程度上被限制。孟世昕利用微滴柱法在雙水相系統(tǒng)與海藻酸鈣凝膠材料結(jié)合生成一種新型復(fù)合凝膠微球，除了提高單分子蛋白的包埋率，還將實現(xiàn)有效組分的可控釋放[29]。與傳統(tǒng)工藝相比，復(fù)合凝膠微球?qū)SA擁有超過90%的包埋率，并驗證了其擁有更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)及強度，且將會適用于多種環(huán)境的應(yīng)用中。

3 結(jié)論與展望

本文研究了雙水相體系中酶催化反應(yīng)在藥物合成方面的幾個應(yīng)用，突現(xiàn)了雙水相體系中酶催化的優(yōu)勢。考慮到化學(xué)反應(yīng)與酶催化工程發(fā)展的要求相結(jié)合，雙水相體系具有廉價易得，條件溫和便于循環(huán)利用，以及在催化反應(yīng)中可以消除底物/產(chǎn)物抑制等特點而被廣泛研究。但由于雙水相也有一些的自身特點限制了其自身的發(fā)展。如果想要提取產(chǎn)物，需要使得兩相混合分離，分離步驟將需要反應(yīng)分離過程耗時耗能。此外，不同的生物活性物質(zhì)在不同的雙水相體系中也具有不同的分配比例，沒有一種普適性的雙水相體系適合所有的酶催化反應(yīng)，導(dǎo)致需要不斷地探索發(fā)現(xiàn)雙水相與酶催化反應(yīng)的契合度。影響溶質(zhì)在雙水相體系中分配比的因素有很多，比如形成雙水相的種類及濃度、溶質(zhì)本身的電荷、分子量、濃度等特性，而萃取的耦合的關(guān)鍵在于需要底物，酶催化劑和產(chǎn)物的分配傾向于不同的相中，這大大增加了選擇合適雙水相體系用于酶催化反應(yīng)的難度。雙水相體系中酶催化反應(yīng)相對于傳統(tǒng)工藝有非常大的優(yōu)勢，值得利用其進行更好地發(fā)展。雙水相體系進行反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)時間較短，經(jīng)濟，綠色，表明雙水相體系有較好的應(yīng)用前景。