劉 暢

(遼寧省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 沈陽 110161)

1 引言

苯胺類化合物是重要的工業(yè)原料，具有致癌、致畸、致突變性，可通過呼吸道、消化道進(jìn)入人體，亦可經(jīng)皮膚吸收。我國環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單已將苯胺、二硝基苯胺、對硝基苯胺、2,6-二硝基苯胺等列入其中。在我國的標(biāo)準(zhǔn)體系中，《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838-2002)中關(guān)于生活飲用水地表水源中苯胺的限值為100 μg/L。由于苯胺類化合物很難被生物降解，易在環(huán)境中造成累積污染，因此，為了有效掌握并控制地表水體中苯胺類的污染狀況、確保公眾用水安全，開發(fā)地表水中簡單實(shí)用且靈敏度較高的檢測方法具有重要意義[1]。

本研究建立了經(jīng)樣品前處理，可同時(shí)檢測生活飲用水及其水源水中苯胺、對硝基苯胺、2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺、2,6-二氯-4-硝基苯胺5種苯胺類化合物的固相萃取-高效液相色譜檢測方法，實(shí)現(xiàn)苯胺類化合物較為快速、簡便的分析。

2 材料與方法

2.1 適用范圍

本方法規(guī)定了測定地表水中5種苯胺類化合物的固相萃取-高效液相色譜法。

本方法適用于生活飲用水及其水源水中苯胺、對硝基苯胺、2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺、2,6-二氯-4-硝基苯胺的測定。

本方法檢出限為：苯胺類0.5 μg/L。

2.2 原理

樣品經(jīng)過濾后，通過固相萃取技術(shù)富集水樣中苯胺類，洗脫液濃縮定容后，用高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)進(jìn)行分離檢測。固相萃取是一種物理萃取過程，包括液相和固相，固相對苯胺類化合物的吸附力大于樣品母液；當(dāng)樣品通過固相萃取柱時(shí)，苯胺類被吸附在固體表面，其他組分則隨樣品母液通過固相萃取柱；最后用洗脫液將苯胺類洗脫下來，用高效液相色譜儀檢測分析，根據(jù)保留時(shí)間和特征吸收譜圖定性，外標(biāo)法定量。

2.3 試劑及藥品

樣品分析、標(biāo)準(zhǔn)樣品配置所使用的試劑除均為色譜純或優(yōu)級純(有特殊規(guī)定的除外)。

甲醇：每批甲醇都要進(jìn)行空白檢驗(yàn)，液相色譜純；去離子水：超純水儀制備，滿足電阻率≥18.2 MΩ/cm，TOC<5 μg/L，不含目標(biāo)化合物；苯胺類標(biāo)準(zhǔn)儲備液及使用液：苯胺類標(biāo)準(zhǔn)儲備液100mg/L，可直接購買有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照產(chǎn)品說明書要求保存，也可用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配置，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度要大于99.0%，用甲醇作溶劑，-10 ℃及以下冷凍、避光保存；苯胺類標(biāo)準(zhǔn)使用液1.00 mg/L，取適量儲備液，甲醇作溶劑進(jìn)行稀釋，-10 ℃及以下冷凍、避光保存，保質(zhì)期一個(gè)月；固相萃取柱：MCX固相萃取柱(500 mg，6 mL)或其他等效固相萃取柱；濾膜：0.45 μm聚四氟乙烯濾膜；硫代硫酸鈉：優(yōu)級純；鹽酸：1.19 g/mL，優(yōu)級純；甲酸：液相色譜純；氨水：0.91 g/mL，優(yōu)級純；氮?dú)猓杭兌取?9.99%。

2.4 儀器設(shè)備、器皿

高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器；色譜柱：HSS T3 液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)或等效色譜柱；固相萃取儀：自動(dòng)或手動(dòng)(帶真空泵)，流速可調(diào)；自動(dòng)濃縮儀：氮吹濃縮儀或其他性能相當(dāng)?shù)脑O(shè)備；各種規(guī)格的微量注射器或移液器。

2.5 樣品的采集、保存

將水樣采集于棕色的磨口玻璃瓶中，樣品瓶要確保充滿、無氣泡，不留空隙。完成樣品采集后，用氨水和甲酸將樣品pH值調(diào)節(jié)至7～8之間，同時(shí)，加入硫代硫酸鈉(加入量：40 mg/500 mL)。水樣中的苯胺類易于降解，需在4 ℃及以下冷藏且避光條件下保存，盡快分析。采樣后應(yīng)在24h內(nèi)進(jìn)行萃取，且萃取后需在7 d內(nèi)進(jìn)行分析[2]。

2.6 分析步驟

2.6.1 前處理

取水樣1000 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜減壓過濾，濾液過MCX固相萃取柱。固相萃取柱使用之前以10 mL甲醇和10 mL去離子水進(jìn)行活化?？刂扑畼右?～10 mL/min的流速通過固相萃取柱，從而進(jìn)行富集濃縮。上樣過程完成后，分別用10 mL 0.1 mol/L 鹽酸和10%甲醇水溶液清洗以凈化樣品，用氮?dú)獯蹈晒滔噍腿≈螅?0 mL 2%氨水甲醇溶液以1 mL/min的流速將固相萃取柱中的組分洗脫下來，洗脫液收集于濃縮瓶內(nèi)，氮吹濃縮至1.0 mL以下，用20%甲醇水溶液定容至1.0 mL，并經(jīng)針頭過濾器過濾，保存待測定[3]。

2.6.2 空白樣品

空白樣品實(shí)驗(yàn)過程即用實(shí)驗(yàn)室用去離子水代替實(shí)際樣品，嚴(yán)格按照2.6.1節(jié)規(guī)定的步驟進(jìn)行空白樣品制備。

2.6.3 液相色譜分析條件(推薦)

色譜柱：HSS T3液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)。 流動(dòng)相：梯度洗脫；V甲醇∶V水(含0.2%乙酸)=35∶65(V/V)，保持15 min，后以線性變化至甲醇∶水=60∶40(V/V)，并保持15 min。 檢測器：配有二極管陣列檢測器(掃描范圍：200～400 nm)，定量波長254 nm或230 nm。 進(jìn)樣體積：10 μL。 流 速：0.8 mL/min。 色譜柱溫：30 ℃。 依據(jù)保留時(shí)間和檢測物質(zhì)特征吸收譜圖進(jìn)行定性分析，使用外標(biāo)法峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。

2.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取100 mg/L苯胺類標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用甲醇稀釋至6個(gè)質(zhì)量濃度(至少5個(gè)質(zhì)量濃度)：1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L和50.0 mg/L。在推薦的液相色譜分析條件下，對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以苯胺類含量(mg/L)對峰面積(μV·s)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.6.5 樣品的測定

在推薦的液相色譜分析條件下，按照2.6.4節(jié)中的要求進(jìn)行樣品的測定。

2.6.6 空白樣品的測定

在推薦的液相色譜分析條件下，按照2.6.5節(jié)中的要求進(jìn)行空白樣品的測定。

2.7 精密度和準(zhǔn)確度

分別取質(zhì)量濃度為1.0 mg/L和10.0 mg/L的苯胺類溶液進(jìn)行6次平行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～8.1%。添加以上濃度水平的水樣進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，回收率為72.2%～96.1%。

3 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

3.1 空白樣品的測定

每批次(≤20個(gè)樣品/批)或每20個(gè)樣品至少應(yīng)進(jìn)行一個(gè)實(shí)驗(yàn)室空白樣品的測定，空白樣品的測定結(jié)果應(yīng)低于方法的檢出限。

3.2 平行樣品

每批次(≤20個(gè)樣品/批)或每20個(gè)樣品至少應(yīng)進(jìn)行一個(gè)平行樣品的測定，平行樣品測定結(jié)果的相對偏差應(yīng)控制在25%以內(nèi)。

3.3 校準(zhǔn)

要針對每批樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995。每批次(≤20個(gè)樣品/批)或每20個(gè)樣品應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一次測定，中間濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定結(jié)果與該點(diǎn)濃度相對誤差需控制在±20%之內(nèi)。

4 結(jié)果與討論

4.1 色譜柱的選擇

苯胺類化合物一般采用C18柱分析。通過實(shí)驗(yàn)對比C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和HSS T3柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)對目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果表明：C18柱對2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺未能實(shí)現(xiàn)完全分離，而HSS T3柱對5種苯胺類化合物均實(shí)現(xiàn)了較好分離[4]。

4.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

通過實(shí)驗(yàn)對比等度淋洗和梯度淋洗對目標(biāo)化合物的分離效果，為了達(dá)到5種苯胺類化合物均良好分離且整體出峰時(shí)間合理，需采用梯度淋洗方式。由于最先出峰的3種苯胺類化合物極性較為相近，需要采用低比例的有機(jī)相才能實(shí)現(xiàn)完全分離，若采用等度淋洗，則會導(dǎo)致后面兩種苯胺類化合物無法被洗脫。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，V甲醇∶V水=35∶65(V/V)，保持15 min，后以線性變化至甲醇∶水=60∶40(V/V)，并保持15 min，可實(shí)現(xiàn)5種苯胺類化合物的良好分離[5]。

苯胺類化合物呈弱堿性，流動(dòng)相若為甲醇-水，形成的色譜峰較寬，有拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)通過在流動(dòng)相的水相中分別添加0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%(V/V)的甲酸，使流動(dòng)相呈酸性，抑制鍵合相表面的未烷基化硅醇羥基的電離趨勢，從而降低二次作用的強(qiáng)度，來考察流動(dòng)相對目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果顯示，甲酸的加入，對峰形有顯著改善，隨著甲酸配比的增加，峰形隨之變尖銳，分離度同步提高。甲酸濃度提高至0.02%(V/V)時(shí)，分離度改善顯著，因此選用水相中加入0.02%甲酸組成流動(dòng)相[6]。

5 注意事項(xiàng)

(1)方法采用的固相萃取柱為MCX柱，此類固相萃取柱主要對弱堿性化合物有較好的萃取效果，若選用其他等效固相萃取柱，萃取柱的活化和洗脫等條件要做對應(yīng)改變。

(2)樣品濃縮過程中，要控制好濃縮速度，不宜過快，切記不要吹干，以免造成苯胺類物質(zhì)的大量損失。

(3)由于苯胺類物質(zhì)的毒性較高，在樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)樣品配置等過程中應(yīng)佩戴防護(hù)器具，在通風(fēng)櫥中操作，避免試劑和樣品接觸皮膚和衣物。

(4)實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的固體廢物務(wù)必嚴(yán)格做到統(tǒng)一收集、分類管控，委托有處理資質(zhì)的機(jī)構(gòu)定期轉(zhuǎn)運(yùn)、處置。

6 干擾和消除

(1)當(dāng)樣品受到基質(zhì)干擾影響測定結(jié)果時(shí)，通過對樣品進(jìn)行預(yù)處理、減少進(jìn)樣體量(稀釋樣品或減少進(jìn)樣體積)、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程條件等方式減少或消除干擾。

(2)當(dāng)樣品存在同分異構(gòu)體干擾影響測定結(jié)果時(shí)，可通過優(yōu)化高效液相色譜的梯度淋洗條件(淋洗液流速、柱溫箱溫度、淋洗液配比等)改善分離度，進(jìn)而減少或消除干擾。

(3)當(dāng)樣品受到余氯等氧化性較強(qiáng)的物質(zhì)干擾影響測定結(jié)果時(shí)，可通過在樣品的采集、保存過程加入一定量的硫代硫酸鈉消除干擾。

7 結(jié)語

本文利用固相萃取-高效液相色譜開發(fā)了一種同時(shí)測定生活飲用水及其水源水中5種苯胺類化合物的檢測方法，方法在1.0 mg/L～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限為苯胺類化合物0.5 μg/L，回收率為72.2%～96.1%。同時(shí)，嘗試對色譜柱進(jìn)行優(yōu)選并對流動(dòng)相的配比和梯度淋洗程序進(jìn)行改進(jìn)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C18色譜柱對2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺未能完全分離，HSS T3柱對5種苯胺類化合物均實(shí)現(xiàn)了較好分離；綜合考慮苯胺類化合物的出峰間隔和試劑成本，對流動(dòng)相的配比和梯度淋洗程序進(jìn)行了優(yōu)化，在流動(dòng)相中加入0.02%甲酸，有效改善苯胺類化合物峰型及分離效果。改良后，方法操作簡單、靈敏度較高，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，能很好地滿足生活飲用水及其水源中苯胺類化合物的日常檢測要求[7～10]。