付 靜，張 晏，劉安楠，楊書文，曹素艷，孫 雪，方 靜

北京醫(yī)院/國家老年醫(yī)學(xué)中心特需醫(yī)療部，北京 100730

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是其中最常見的亞型，占所有甲狀腺癌的30%[1]。PTC預(yù)后較好，但也可侵襲淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)，約40%的PTC患者可能出現(xiàn)同側(cè)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2-3]。目前的治療方法包括外科甲狀腺切除術(shù)，放射性碘(RAI)消融治療等[4]。鈣黏著蛋白(鈣依賴性細(xì)胞黏附分子)參與維持組織上皮結(jié)構(gòu)，對胚胎發(fā)育和正常組織結(jié)構(gòu)的維持具有重要作用[5-6]。E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)是一種黏附分子，通常在多類癌癥(如乳腺癌和結(jié)腸直腸癌)中過表達(dá)，并被認(rèn)為是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的誘導(dǎo)劑，在癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段起重要作用[7]。鋅指結(jié)合蛋白1(ZEB1)是一種含鋅指的轉(zhuǎn)錄因子，可以下調(diào)E-cadherin的表達(dá)并上調(diào)N-鈣黏著蛋白的表達(dá)，這與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8]。最近的研究報(bào)道，通過抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄表達(dá)，ZEB1可以觸發(fā)EMT進(jìn)程，使上皮細(xì)胞從原始位置遷移并形成中胚層和神經(jīng)原位癌組織，這與腫瘤侵襲性進(jìn)展有關(guān)[9]。本研究擬探討PTC組織中E-cadherin、ZEB1表達(dá)水平與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為PTC的診斷及治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2014年6月至2017年9月收治的68例PTC患者作為研究對象，其中男30例，女38例，平均年齡(59.33±15.36)歲，平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(24.69±3.25)kg/m2。所有患者經(jīng)超聲檢查及細(xì)胞學(xué)病理檢查確診，均在本院接受了PTC切除術(shù)，且均未接受術(shù)前化療。取PTC患者癌組織為病例組，同時取癌旁正常組織(距癌組織5 cm以上)為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床病理特征收集 收集研究對象的臨床病理特征，包括年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)情況。

1.2.2E-cadherin、ZEB1 mRNA表達(dá)水平檢測 使用Trizol試劑(美國Life Technologies公司)提取總RNA。為定量E-cadherin、ZEB1水平，使用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用TaqMan miRNA分析(美國Applied Biosystems公司)來測量E-cadherin、ZEB1的表達(dá)。使用U6小核RNA作為內(nèi)部對照。通過SYBR綠色PCR測定法(美國Qiagen公司)檢測E-cadherin、ZEB1 mRNA的表達(dá)水平。引物序列如下：E-cadherin，正向，5′-GGGAGATCAGAAGGTGA TT-3′；反向，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6正向，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；反向，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。ZEB1，正向，5′-AGCAGCAAGAAGAACAAACAAGGG-3′；反向，5′-AGTGACTAATGGCTCTGTGATGGC-3′。GAPDH，正向，5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGTTG-3′；反向，5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。熒光定量PCR條件：50 ℃ 10 min，92 ℃ 60 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共60個循環(huán)。

1.2.3E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)水平檢測 免疫組織化學(xué)(IHC)：將福爾馬林固定和石蠟包埋的標(biāo)本切片(5 μm厚)用二甲苯脫蠟，并按乙醇100%、95%、70%、50%和30%的降序水化。將載玻片浸入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，然后在微波爐中煮沸10 min，以進(jìn)行熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)。將切片用10%的正常山羊血清在室溫下封閉，非特異性結(jié)合30 min。隨后將切片與上述兔抗E-cadherin、ZEB1一抗(1∶200；英國Abcam公司)在4 ℃孵育過夜，隨后將玻片與過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)抗兔IgG二抗孵育在室溫下放置30 min，最后將切片在室溫下使用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺染色10 s至1 min，然后用0.5%蘇木精復(fù)染，在室溫下放置1 s。隨后，將載玻片脫水并固定。IHC染色由本院病理科的兩名病理醫(yī)師獨(dú)立評分。在光學(xué)顯微鏡(德國Carl Zeiss AG公司)下，以200放大倍數(shù)在每個樣品的5個視野中評估免疫染色。細(xì)胞內(nèi)棕色染色的存在被認(rèn)為是E-cadherin、ZEB1的陽性染色。代表陽性細(xì)胞百分比的得分如下：0分，≤5%；1分，>5%～20%；2分，>20%～50%；3分，>50%。染色強(qiáng)度評分如下：0分，陰性染色；1分，染色力弱；2分，中度染色；3分，染色力強(qiáng)。將兩個評分的乘積用作總?cè)旧u分。

1.3隨訪 隨訪方式為電話及門診聯(lián)合隨訪，內(nèi)容主要為術(shù)后生存狀況，隨訪開始日期為出院日期，結(jié)束日期為2019年12月1日。

2 結(jié) 果

2.1兩組E-cadherin、ZEB1 mRNA表達(dá)水平比較 病例組E-cadherin mRNA表達(dá)水平低于對照組，ZEB1 mRNA表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組ZEB1、E-cadherin mRNA表達(dá)水平比較

2.2兩組E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)情況比較 病例組E-cadherin蛋白表達(dá)評分、陽性率低于對照組 (P<0.05)；ZEB1蛋白表達(dá)評分、陽性率高于對照組(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 對照組、病例組中E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)情況比較

2.3不同臨床病理特征對E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)的影響 E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)情況在不同腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)情況患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且當(dāng)腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)時，E-cadherin蛋白表達(dá)陽性率越低，ZEB1蛋白表達(dá)陽性率越高。而PTC組織E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)情況在<50歲和≥50歲患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

注：A、B為E-cadherin蛋白在對照組、病例組中的表達(dá)情況；C、D為ZEB1蛋白在對照組、病例組中的表達(dá)情況。

表3 不同臨床病理特征對E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)的影響[n(%)]

續(xù)表3 不同臨床病理特征對E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)的影響[n(%)]

2.4不同E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)水平患者預(yù)后比較 與E-cadherin陰性組比較，E-cadherin陽性組3年生存率升高及生存期延長；與ZEB1陽性組比較，ZEB1陰性組3年生存率升高、生存期延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)水平患者預(yù)后比較

2.5PTC患者預(yù)后影響因素分析 將PTC患者的年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、E-cadherin和ZEB1蛋白表達(dá)情況等變量納入多元Cox逐步回歸分析，結(jié)果顯示年齡≥50歲(HR=1.57，95%CI：1.16～2.13)和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(HR=2.07，95%CI：1.26～3.41)為PTC患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，E-cadherin蛋白陽性(HR=0.54，95%CI：0.34～0.86)和ZEB1蛋白陰性(HR=0.61，95%CI：0.46～0.81)為PTC患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表5。

表5 PTC患者預(yù)后影響因素Cox回歸分析

3 討 論

甲狀腺癌起源于濾泡上皮細(xì)胞，由多種惡性表型組成，包括未分化、低分化和高分化的甲狀腺癌，高分化甲狀腺癌分為兩類：濾泡性甲狀腺癌和PTC[10]。PTC的典型治療策略是外科手術(shù)輔以術(shù)后甲狀腺激素抑制治療和RAI消融治療，但患者如果對這種治療模式反應(yīng)率低，其生存率不高。因此，尋找PTC臨床病理特征的敏感標(biāo)志物對于PTC治療策略的制訂意義重大。

本研究結(jié)果顯示，病例組E-cadherin mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)評分、蛋白表達(dá)陽性率低于對照組，ZEB1 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)評分、蛋白表達(dá)陽性率高于對照組，提示PTC組織中E-cadherin表達(dá)水平降低、ZEB1表達(dá)水平升高。E-cadherin屬于鈣黏著蛋白家族，其主要成分是單鏈跨膜糖蛋白。E-cadherin可能與β-連環(huán)蛋白(β-catenin)相互作用形成cadherin/catenin復(fù)合物，以維持上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[11-12]。同時，E-cadherin表達(dá)的下調(diào)也參與了EMT過程以及腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[13]。

ZEB1在多種類型上皮癌中過表達(dá)，包括肝細(xì)胞癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等，其表達(dá)失調(diào)與癌癥患者的不良結(jié)局有關(guān)；通過誘導(dǎo)EMT過程，ZEB1能促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并可能賦予癌細(xì)胞抗化學(xué)性和干性[14]。對其他癌癥的研究還表明，E-cadherin可以通過直接抑制ZEB1的轉(zhuǎn)錄來削弱癌細(xì)胞之間的黏附特性，從而導(dǎo)致乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，PTC組織中E-cadherin表達(dá)水平降低、ZEB1表達(dá)水平升高，與既往研究結(jié)果一致。

進(jìn)一步分析不同臨床病理特征對E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)情況在不同腫瘤最大徑、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)情況患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且當(dāng)腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)時，E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率越低，ZEB1蛋白陽性表達(dá)率越高(P<0.05)，提示ZEB1有促進(jìn)PTC侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，而E-cadherin對PTC則具有抑制作用。多項(xiàng)細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果顯示，下調(diào)ZEB1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)耐藥性肺癌的EMT過程，使用Ⅰ類組蛋白脫乙?；敢种苿㎝ocetinostat干擾ZEB1功能會上調(diào)miR-203的水平，誘導(dǎo)癌細(xì)胞對化療敏感[16-17]。同時，由沙利霉素引起的ZEB1表達(dá)下調(diào)降低了套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞對吉西他濱、阿糖胞苷和阿霉素的細(xì)胞毒性作用的抵抗力[18]。這些證據(jù)表明ZEB1具有促癌作用。E-cadherin調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并已被確定為多種類型腫瘤的非侵襲性生物標(biāo)志物[19]。在肺癌患者中測得E-cadherin水平明顯降低，E-cadherin的失調(diào)可能對肺癌的診斷很有價值[20]。此外，E-cadherin能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長和遷移，較高水平的E-cadherin與肝癌的侵襲性有關(guān)。既往研究表明，E-cadherin能靶向作用于某些致癌基因或腫瘤抑制因子，例如E-cadherin通過調(diào)節(jié)激活轉(zhuǎn)錄因子2抑制肺癌的發(fā)展，通過調(diào)節(jié)雌激素受體α和自噬增加乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性，與本研究結(jié)果一致[21-22]。PTC患者預(yù)后因素分析顯示，E-cadherin陽性組、ZEB1陰性組3年生存率升高、生存期延長，說明E-cadherin蛋白表達(dá)陽性，ZEB1蛋白表達(dá)陰性的PTC患者能獲得較好的預(yù)后。

綜上所述，PTC組織中E-cadherin表達(dá)水平降低、ZEB1表達(dá)水平升高； PTC的臨床病理特征會影響E-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)情況；E-cadherin蛋白表達(dá)陽性、ZEB1蛋白表達(dá)陰性的PTC患者能獲得較好的預(yù)后。