杜 雄，李延新，段小瑞，康 婷

延安大學(xué)附屬醫(yī)院：1.病理科;2.腫瘤科，陜西延安 716000

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在中國(guó)其發(fā)病率位居惡性腫瘤第三位，病死率位居第二位，雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，胃癌的手術(shù)和化療均取得了一定的進(jìn)展，胃癌患者的5年生存率逐漸提高，但仍低于30%[1-3]。由于缺乏早期診斷的特異性標(biāo)志物，胃癌患者往往在確診時(shí)就已經(jīng)處于中晚期，錯(cuò)過了手術(shù)和化療的最佳時(shí)機(jī)，并且胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不明確，治療靶點(diǎn)受限[4-5]，所以探究胃癌的發(fā)生機(jī)制對(duì)于其臨床診斷和治療至關(guān)重要。

腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境細(xì)胞受到多種應(yīng)激因素的影響，例如缺氧、代謝應(yīng)激、氧化應(yīng)激等[6]。缺氧是實(shí)體腫瘤的特征，癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)導(dǎo)致局部缺氧，進(jìn)而刺激腫瘤微環(huán)境中的各種基質(zhì)細(xì)胞對(duì)腫瘤產(chǎn)生影響[7-8]。間充質(zhì)干細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。腫瘤外泌體是腫瘤細(xì)胞所分泌的納米級(jí)囊泡，可調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等[10]。但在缺氧條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞的影響研究較少，本研究探討了缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hBMSCs(美國(guó)ScienCell公司，Cat.XY-XB-1578)，人胃癌細(xì)胞MGC-803(美國(guó)ScienCell公司，Cat.ml-cs-0276)，兔源CD9抗體、兔源CD63抗體、兔源TSG101抗體、兔源p-β-catenin抗體、兔源β-catenin抗體(英國(guó)Abcam公司，Cat.分別為ab92726、ab134045、ab125011、ab246504、ab32572)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(沈陽(yáng)萬類生物技術(shù)有限公司，Cat.WLA030b)，CCK8檢測(cè)試劑盒(沈陽(yáng)萬類生物技術(shù)有限公司，Cat.WLA074)，兔源CD44抗體、兔源c-myc抗體、兔源cyclin D1抗體、兔源GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(沈陽(yáng)萬類生物技術(shù)有限公司，Cat.分別為WL03531、WL01781、WL01435a、WL01114、WLA023)，Matrigel膠(福麥斯生物技術(shù)有限公司，Cat.356234)，無外泌體胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，Cat.A2720801)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)，透射電鏡(日本Hitachi公司)，0.4 μm的Transwell小室(美國(guó)康寧公司，Cat.3413)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) (1)正常的hBMSCs培養(yǎng)：取液氮保存的細(xì)胞，于37 ℃水浴鍋中迅速解凍，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，hBMSCs培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1%谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基中，MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于含5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。(2)缺氧誘導(dǎo)的hBMSCs培養(yǎng)：將hBMSCs細(xì)胞置于0.2% O2，5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)2 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于提取外泌體。

1.2.2外泌體的提取與鑒定 使用差速離心法提取正常間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(Nom-exo)、缺氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(Hypo-exo)，將正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)的hBMSCs培養(yǎng)基更換為無外泌體胎牛血清配制的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用差速離心法收集細(xì)胞上清液中的外泌體，主要步驟為：將上清液以3 000×g，4 ℃離心15 min去除死細(xì)胞；然后將上清液以6 000×g離心40 min，去除細(xì)胞碎片；10 000×g離心1 h，取上清液；100 000×g離心1 h，收集沉淀，用400 μL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸外泌體。使用透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，拍照記錄。使用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101的表達(dá)水平。將MGC-803細(xì)胞分為Nom-exo組、Hypo-exo組和PBS組，分別與10 μg/mL的Nom-exo、Hypo-exo以及等體積的PBS溶液共孵育24 h后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3細(xì)胞增殖 采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，將MGC-803細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每孔加入適量外泌體，使外泌體終濃度為10 μg/mL，96孔板中體積為100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置24 h、48 h、72 h時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出96孔板，每孔加入10 μL的CCK8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度(A)值，A值越大，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.2.4細(xì)胞凋亡 將MGC-803細(xì)胞接種于6孔板中，加入外泌體，使其終水平為10 μg/mL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，用500 μL的染色緩沖液重懸細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，隨后添加5 μL的異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μL的碘化丙啶染料(PI)，混勻后室溫避光孵育15 min，并設(shè)置Annexin V-FITC和PI單陽(yáng)性管用于熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，空白管用于電壓調(diào)節(jié)；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述各樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.2.5細(xì)胞遷移與侵襲 Transwell小室用于檢測(cè)細(xì)胞遷移，Matrigel膠于4 ℃融化后，取50 μL平鋪于Transwell小室中用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲。取MGC-803細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋至2.5×104個(gè)/毫升，取200 μL細(xì)胞接種于Transwell小室中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)小室中加入外泌體，使其終水平為10 μg/mL，小室放置于24孔板中，每孔加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，并將上述24孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，小室底部用PBS清洗后用無水乙醇固定30 min，然后將小室倒扣，底部滴加結(jié)晶紫染色10 min，清洗后晾干，于顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)，比較各組細(xì)胞遷移數(shù)及侵襲數(shù)。

1.2.6Western blot 取各組與10 μg/mL外泌體共孵育后的MGC-803細(xì)胞1×106個(gè)，加入200 μL RIPA蛋白裂解液和2 μL PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min后，以12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒定量，定量后各組蛋白加入上樣緩沖液煮沸30 min，使蛋白樣品充分變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)聚偏二氟乙烯膜(PVDF)封閉2 h，然后以1∶1 000比例稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配制發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1外泌體提取及鑒定 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)果顯示，外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈“杯托樣”，粒徑在30～100 nm，Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白結(jié)果顯示，差速離心法提取的外泌體表達(dá)標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特征。見圖1～2。

圖1 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響 相比于PBS組，Nom-exo組MCG-803細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞增殖能力亦顯著增加(P<0.05)，相比于Nom-exo組MCG-803細(xì)胞，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05)。見圖3。

圖2 Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)

圖3 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.3缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡水平的影響 相比于PBS組，Nom-exo組MGC-803細(xì)胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)；而相比于Nom-exo組，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞凋亡水平亦顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：A、B、C分別為PBS組、Nom-exo組、Hypo-exo組細(xì)胞凋亡圖；D為細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)值圖。

2.4缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響 相比于PBS組，Nom-exo組MGC-803細(xì)胞遷移數(shù)目顯著增加(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞遷移數(shù)目顯著增加(P<0.05)；相比于Nom-exo組，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞遷移數(shù)目亦顯著增加(P<0.05)。見圖5。

注：A、B、C分別為PBS組、Nom-exo組、Hypo-exo組細(xì)胞遷移圖；D為平均細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)值圖。

2.5缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Nom-exo組MGC-803細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著高于PBS組(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著高于PBS組(P<0.05)；并且Hypo-exo組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著高于Nom-exo組細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.05)。見圖6。

注：A、B、C分別為PBS組、Nom-exo組、Hypo-exo組細(xì)胞侵襲圖；D為平均細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)值圖。

2.6缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)素(β-catenin)信號(hào)通路的影響 相比于PBS組，Nom-exo和Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞中β-catenin磷酸化水平顯著升高(P<0.05)，CD44、c-myc、G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，并且Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞β-catenin磷酸化水平，CD44、c-myc、Cyclin D1表達(dá)水平均顯著高于Nom-exo組(P<0.05)。見圖7。

注：A為各組蛋白表達(dá)情況；B、C、D、E分別為CD44、c-myc、Cyclin D1、p-β-catenin/β-catenin表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)值圖。

3 討 論

在腫瘤的生長(zhǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速并且超過腫瘤血管新生的速度，腫瘤細(xì)胞群周圍毛細(xì)血管的氧有效彌散范圍不能滿足腫瘤快速生長(zhǎng)的需要，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)毛細(xì)血管的氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不均，由此形成腫瘤缺氧微環(huán)境。缺氧亦是腫瘤微環(huán)境的重要特征，研究表明，實(shí)體腫瘤中缺氧區(qū)域占0.35%～4.25%，中位氧含量約為2%[11]。缺氧的腫瘤微環(huán)境會(huì)調(diào)控腫瘤的血管新生、腫瘤代謝、免疫應(yīng)答、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及腫瘤耐藥等過程[12]。間充質(zhì)干細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要基質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中改造腫瘤微環(huán)境，調(diào)控腫瘤血管新生及免疫逃逸[13]。外泌體是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，腫瘤微環(huán)境中的多種基質(zhì)細(xì)胞均可通過分泌外泌體作為旁分泌介質(zhì)而調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究探討了缺氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。

本研究通過差速離心法提取了Nom-exo和Hypo-exo，鑒定結(jié)果顯示，所提取的Nom-exo和Hypo-exo形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)均符合外泌體的特征。有研究表明，缺氧條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體微小RNA(miR)-193a-3p、miR-210-3p、和miR-5100通過激活STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲[14]。缺氧條件也可通過多種途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，研究表明，低氧誘導(dǎo)的miR-224會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，缺氧可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化而誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生發(fā)展[15-16]。為了探究缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體是否對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有影響，本研究將Nom-exo和Hypo-exo與胃癌細(xì)胞共孵育后發(fā)現(xiàn)，相比于Nom-exo組，Hypo-exo組胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖能力顯著增加，細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲能力也顯著增加，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞的水平顯著低于Nom-exo組，提示缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體也可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的經(jīng)典通路，該通路激活后β-catenin能夠與其他蛋白分子結(jié)合形成復(fù)合物，在病理?xiàng)l件下可調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。c-myc、CD44、cyclin D1是Wnt信號(hào)通路下游的靶基因，隨著Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活而激活，調(diào)控原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18-19]。已有許多研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，例如，Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過H3賴氨酸27乙酰化的表觀遺傳調(diào)控促進(jìn)胃癌進(jìn)展，Wnt/β-catenin途徑與多種微小RNA(miRNA)之間的相互作用可調(diào)節(jié)胃癌EMT，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于Nom-exo組，Hypo-exo組MGC-803細(xì)胞c-myc、CD44、cyclin D1表達(dá)水平均顯著升高，β-catenin磷酸化水平亦顯著升高，即Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，說明缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，Hypo-exo能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制為激活胃癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，但是外泌體中包含多種物質(zhì)，研究最廣泛的是miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA等，所以間充質(zhì)干細(xì)胞中何種物質(zhì)發(fā)揮調(diào)控作用還需進(jìn)一步研究。