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        miR-663調(diào)控MMP11對妊娠滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移的影響

        2021-11-26 07:29:38段昆茂王世芳陳周紅
        國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志 2021年22期
        關(guān)鍵詞:水平檢測

        段昆茂,王世芳△,陳周紅

        1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院產(chǎn)科,重慶 401420; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 401120

        子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種特殊類型,一般表現(xiàn)為妊娠女性在妊娠20周以后出現(xiàn)水腫、蛋白尿、高血壓,在分娩以后血壓恢復(fù)正常[1]。目前尚不清楚子癇前期的具體發(fā)病機制和病因,已知滋養(yǎng)層細胞是胎盤的主要組成部分,在胎盤形成和胎兒正常發(fā)育過程中具有重要作用,滋養(yǎng)層細胞侵入子宮螺旋動脈受限和過淺均可能夠誘導(dǎo)子癇前期的發(fā)生,改善滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移能力可能是抑制子癇前期的重要步驟[2]。微小RNA(miRNA)是一類沒有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA,可以通過與靶基因的3端非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合影響蛋白翻譯[3]。miRNA的功能很多,如調(diào)控細胞分化、凋亡、炎癥、衰老、氧化損傷、增殖等,還與很多疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。既往研究顯示,子癇前期患者胎盤組織中miRNA表達異常,且影響滋養(yǎng)層細胞的功能[5]。miR-663是與腫瘤有關(guān)的調(diào)控因子,還與鼻息肉的產(chǎn)生、燙傷修復(fù)等過程密切相關(guān)[6-8]。研究顯示,miR-663在子癇前期患者中高表達[9]。目前尚不清楚miR-663在妊娠滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲中的作用。前期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),miR-663和基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP11)的3′UTR端有互補結(jié)合位點,MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,在細胞運動、侵襲過程中發(fā)揮促進作用[10]。本研究通過探討miR-663調(diào)控MMP11對妊娠滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲的影響及機制,以期為改善子癇前期的預(yù)后提供方向。

        1 資料與方法

        1.1一般資料 收集2018年7月至2020年7月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院收治的妊娠期子癇前期患者行剖宮產(chǎn)留取的胎盤組織19例,同時收集健康妊娠女性行剖宮產(chǎn)留取的胎盤組織19例(對照組織)。

        1.2方法

        1.2.1實驗細胞與試劑 妊娠滋養(yǎng)層JEG-3細胞購自上海通派生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)液、CCK-8、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;miR-663 模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-663)、模擬對照序列(miR-NC)及抑制劑對照序列(anti-miR-NC)由上海安必奇生物科技有限公司構(gòu)建;MMP11過表達載體及其小干擾RNA(si-MMP11)、空載體(vector)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、MMP11野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告載體均由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建;MMP11、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自上海齊一生物科技有限公司。

        1.2.2miR-663和MMP11 mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR檢測miR-663和MMP11 mRNA表達水平。采用Trizol試劑提取子癇前期患者胎盤組織和對照組織中的總RNA,利用紫外分光光度計檢測RNA水平和純度。然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性60 s;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。利用2-△△Ct法分析目的基因的表達變化,miR-663內(nèi)參為U6,MMP11 mRNA內(nèi)參為GAPDH。PCR引物為:U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′;miR-663上游引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′,下游引物5′-TTTAGGCGGGGCG-3′;MMP11上游引物5′-TTCTACACCTTCCGCTACC-3′,下游引物5′-GGACTGGCTTCTCACCATCATAT-3′;GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

        1.2.3細胞培養(yǎng)和分組 復(fù)蘇JEG-3細胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將2.5 mL對數(shù)期JEG-3細胞(5.0×104個/毫升)接種至6孔板中,用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-663(anti-miR-663組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-663 mimics(miR-663組)、Vector(Vector組)、MMP11過表達載體(MMP11組),共轉(zhuǎn)染anti-miR-663與si-NC(anti-miR-663+si-NC組)、anti-miR-663與si-MMP11(anti-miR-663+si-MMP11組)。同時設(shè)置對照組(Control組):不進行任何轉(zhuǎn)染操作,常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后,更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后,采用qRT-PCR檢測Control組、anti-miR-NC組和anti-miR-663組miR-663表達驗證轉(zhuǎn)染效果,具體方法同1.2.2;采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、miR-NC組和miR-663組細胞中MMP11蛋白表達水平,觀察miR-663對細胞中MMP11蛋白表達水平的影響,同時檢測Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組、anti-miR-663+si-MMP11組MMP11蛋白表達驗證轉(zhuǎn)染效果。

        1.2.4細胞增殖檢測 采用CCK-8法檢測Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細胞增殖情況。將0.2 mL各組細胞(5.0×104個/毫升)接種到96孔板,培養(yǎng)24 h后,每孔加10 μL CCK-8。孵育3 h,在酶標儀上測定450 nm處吸光度(A)值。

        1.2.5細胞遷移和侵襲檢測 利用孔徑為8 μm的Transwell小室測定Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細胞遷移及侵襲情況。侵襲實驗:預(yù)先在Transwell小室的上室添加人工基質(zhì)膠,自然晾干。然后于上室加100 μL各組細胞懸液(5.0×104個/毫升),下室中添加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱中孵育24 h,將Transwell小室取出,擦掉沒有穿膜的細胞,放在4%多聚甲醛溶液中固定10 min,將小室取出,風(fēng)干后進行蘇木精染色。選擇4個視野,計數(shù)細胞穿膜數(shù)量。遷移實驗:除不鋪基質(zhì)膠外,步驟與侵襲實驗相同。

        1.2.6靶向關(guān)系預(yù)測及鑒定 采用生物信息學(xué)軟件targetscan分析miR-663的靶基因。以熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。將miR-663 mimics、miR-NC分別和WT、MUT熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染到JEG-3細胞,培養(yǎng)24 h后,用熒光素酶活性測定試劑盒分析細胞熒光素酶活性變化。

        1.2.7MMP11蛋白表達水平檢測 采用Western blot檢測各組細胞中MMP11蛋白表達水平。將2.5 mL各組細胞(5.0×104個/毫升)接種至6孔板中,培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,用RIPA試劑提取細胞中總蛋白,用BCA法測定蛋白表達水平。用微量加樣器取25 μg的蛋白樣品分別加入SDS-PAGE凝膠樣品孔內(nèi),接通電源。前30 min,以70 V的電壓電泳,然后調(diào)整為100 V繼續(xù)電泳約1.5 h,肉眼可見藍色染料進入到底部邊緣。取出凝膠,放在電轉(zhuǎn)液內(nèi)結(jié)合15 min。設(shè)置100 V的電壓轉(zhuǎn)膜1 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,并浸泡在含有5%脫脂奶粉的平皿內(nèi),在室溫孵育2 h。然后放在MMP11(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液中于4 ℃冰箱中孵育過夜,洗膜后,再放在二抗(1∶2 000)溶液中室溫孵育2 h。滴加顯影液避光顯影,曝光拍照,分析條帶灰度值。以MMP11與GAPDH灰度值的比值表示MMP11蛋白表達水平。

        2 結(jié) 果

        2.1子癇前期患者胎盤組織和對照組織中miR-663表達水平比較 與對照組織比較,子癇前期患者胎盤組織中miR-663表達水平升高(P<0.05),miR-663在子癇前期患者胎盤組織中呈高表達,見圖1。

        注:與對照組織比較,*P<0.05。

        2.2miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細胞中miR-663表達水平比較 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細胞中miR-663表達水平降低(P<0.05),見表1。

        表1 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細胞中miR-663表達水平比較

        2.3下調(diào)miR-663對妊娠滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細胞增殖活性升高,遷移和侵襲數(shù)目增加(P<0.05)。下調(diào)miR-663能促進妊娠滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲。見表2。

        表2 下調(diào)miR-663對妊娠滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲的影響

        2.4miR-663與MMP11的關(guān)系 生物信息學(xué)軟件顯示miR-663和MMP11存在結(jié)合位點,見圖2,提示miR-663和MMP11為靶向關(guān)系。與miR-NC組比較,miR-663 mimics和WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細胞熒光素酶活性降低(P<0.05),見表3。

        圖2 miR-663和MMP11結(jié)合位點

        表3 miR-663 mimics和MUT、WT共轉(zhuǎn)染后的妊娠滋養(yǎng)層細胞熒光素酶活性比較

        2.5miR-663對MMP11表達的調(diào)控作用 與Control、anti-miR-NC組比較,anti-miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細胞中MMP11蛋白表達水平升高(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-663組妊娠滋養(yǎng)層細胞中MMP11蛋白表達水平降低(P<0.05),提示miR-663負調(diào)控MMP11表達。見圖3、表4。

        表4 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細胞中MMP11蛋白表達水平比較

        圖3 miR-663 inhibitor轉(zhuǎn)染后妊娠滋養(yǎng)層細胞中MMP11蛋白表達情況

        2.6子癇前期患者胎盤組織和對照組織中MMP11 mRNA表達水平比較 與對照組織比較,子癇前期患者胎盤組織MMP11 mRNA表達水平降低(P<0.05),提示MMP11 mRNA在子癇前期患者中表達下調(diào)。見圖4。

        注:與對照組織比較,*P<0.05。

        2.7抑制MMP11逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-663對妊娠滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與Control、Vector組比較,MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細胞中MMP11蛋白表達水平升高,增殖活性升高,侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目增加(P<0.05)。與anti-miR-663+si-NC組比較,anti-miR-663+si-MMP11組妊娠滋養(yǎng)層細胞中MMP11蛋白表達水平降低,增殖活性降低,侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目減少(P<0.05)。見圖5、表5。

        圖5 Western blot檢測妊娠滋養(yǎng)層細胞中MMP11蛋白表達

        表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細胞MMP11蛋白表達水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

        續(xù)表5 各組妊娠滋養(yǎng)層細胞MMP11蛋白表達水平、增殖活性(A值)、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目比較

        3 討 論

        胚胎發(fā)育與功能性胎盤的形成有關(guān),囊胚期的胚胎細胞分化形成內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)外胚層細胞,內(nèi)細胞團分化形成胎兒,滋養(yǎng)外胚層細胞分化形成不同的滋養(yǎng)層細胞,滋養(yǎng)層細胞不斷增殖分化,最終形成具有侵襲能力的多層絨毛外滋養(yǎng)層細胞,絨毛外滋養(yǎng)層細胞遷移、侵襲至子宮蛻膜,進入母體的螺旋動脈,維持子宮正常功能,為胚胎發(fā)育提供有利條件[11-12]。研究顯示,滋養(yǎng)層細胞侵襲、遷移受限是子癇前期發(fā)生的關(guān)鍵原因[13]。

        miRNA是一類長度在22 nt左右的非編碼RNA分子,這類分子可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其靶基因的表達[14]。miRNA在進化上極為保守,在不同組織和細胞中的表達豐度不同[15]。miRNA的異常表達常常與疾病有關(guān),如miRNA在腫瘤中可發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用,通過影響細胞的增殖、凋亡等發(fā)揮作用[16]。現(xiàn)階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個miRNA,影響人體內(nèi)30%的基因表達,在生命進程中發(fā)揮十分重要的作用[17]。miRNA在子癇前期中可通過調(diào)控滋養(yǎng)層細胞的遷移和侵襲發(fā)揮作用[18]。既往研究表明,子癇前期患者胎盤組織中miR-663表達水平升高,提示miR-663可能參與子癇前期的發(fā)病過程[9]。本研究結(jié)果顯示,miR-663在子癇前期患者中表達水平升高,并且下調(diào)miR-663可加快滋養(yǎng)層細胞的增殖,誘導(dǎo)細胞遷移和侵襲,miR-663可能具有加快子癇前期進展的作用。

        miRNA的功能多樣性與其調(diào)控機制有關(guān),miRNA與靶基因的3′UTR端通過堿基互補結(jié)合,進而影響靶蛋白的表達,并且同一個miRNA可同時有多個靶基因,分別參與不同的生理、病理調(diào)控過程[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-663與MMP11的3′UTR端互補結(jié)合,并且miR-663靶向負調(diào)控MMP11表達。MMP11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,而基質(zhì)金屬蛋白酶家族是細胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白酶[21-22]。細胞合成的基質(zhì)降解酶能夠為細胞的運動、遷移和侵襲提供條件[23]。本研究發(fā)現(xiàn),子癇前期胎盤組織中MMP11表達水平降低,并且上調(diào)MMP11可增強滋養(yǎng)層細胞的侵襲、遷移和增殖能力,提示MMP11在子癇前期中可能發(fā)揮抑制作用。同時本研究還設(shè)置了逆轉(zhuǎn)實驗,證明抑制MMP11逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-663對滋養(yǎng)層細胞侵襲、遷移和增殖的促進作用,這進一步說明下調(diào)miR-663可使MMP11的表達下調(diào),從而促進滋養(yǎng)層細胞的侵襲、遷移和增殖,miR-663在子癇前期中的作用機制可能與MMP11有關(guān)。

        綜上所述,miR-663可能具有促進子癇前期發(fā)展的作用,并且下調(diào)miR-663可靶向促進MMP11增強滋養(yǎng)層細胞的侵襲、遷移和增殖能力,目前尚不明確miR-663是否能通過其他途徑影響滋養(yǎng)層細胞侵襲,這些內(nèi)容會在以后的研究中進一步探討。本研究為明確子癇前期的分子發(fā)生機制和靶向基因治療子癇前期提供了思路。

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