張 珂，張開炯，吳立春，陳 莉

四川省腫瘤醫(yī)院·研究所/四川省癌癥防治中心/電子科技大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院：1.輸血科；2.檢驗科，四川成都 610041

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居第一[1]。世界衛(wèi)生組織2020年最新癌癥報告顯示，乳腺癌新增人數(shù)達226萬，正式取代肺癌成為全球第一大癌癥。盡管近年來乳腺癌的治療方法已有很大改善，但由于個體差異，預(yù)后仍然不理想[2]。因此，有必要找到敏感而精確的生物標志物，以更好地預(yù)測乳腺癌患者的生存和預(yù)后。微小RNA(miRNA)是一種由21～23個核苷酸組成的高度保守的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子[3]。現(xiàn)已證明miRNA可靶向超過60%的人類基因[4]，幾乎參與了每個生物學過程，包括發(fā)育，血管生成，細胞分化、增殖、存活、侵襲、凋亡，傷口愈合和免疫細胞功能等[5]。既往研究證實，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和患者存活中起重要作用，其能夠作為腫瘤的潛在治療工具和診斷生物標志物[6-7]。近年來，許多集中于乳腺癌miRNA表達譜的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在預(yù)測患者預(yù)后中已顯示出巨大希望[8]。然而，miRNA在乳腺癌中的生物學功能仍不為人所知，為提高乳腺癌預(yù)后的預(yù)測準確性，仍需要系統(tǒng)地研究多種miRNA的表達，利用整體的危險評分進行預(yù)后評價。因此，鑒定出更強大和實用的miRNA信號具有重要的臨床意義。本研究通過開發(fā)和驗證基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫的miRNA預(yù)后模型，并進一步系統(tǒng)地評估該模型對乳腺癌患者總體生存的預(yù)測價值，以明確miRNA作為乳腺癌預(yù)后生物標志物的可靠性。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 從TCGA數(shù)據(jù)庫 (https://portal.gdc.cancer.gov/)下載1 086例乳腺癌組織和804例正常組織的miRNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息。

1.2方法

1.2.1差異表達miRNA篩選 采用R語言edgeR程序包篩選腫瘤組織與正常組織之間差異表達的miRNA，以FDR<0.05和log2|fold change|>1作為篩選標準。

1.2.2預(yù)后相關(guān)miRNA篩選 將1 086例乳腺癌患者表達矩陣和臨床信息進行清洗，剔除連續(xù)表達量低的數(shù)據(jù)，將清洗后剩余的1 033例乳腺癌患者按照7∶3比例分為訓練組(723例)與驗證組(310例)，首先使用R程序包survival進行單因素Cox回歸分析，其次采用glmnet程序包進行LASSO回歸分析，再次使用survival包進行逐步多因素Cox回歸分析，以赤池信息準則(AIC)為準，選取AIC信息統(tǒng)計量最小的模型為最終模型，以P<0.05作為篩選標準，P<0.05說明該變量為獨立的預(yù)后影響因素。

1.2.3miRNA風險模型構(gòu)建與驗證 將單因素Cox回歸分析與LASSO回歸分析篩選出的miRNA進行逐步多因素Cox回歸分析，建立預(yù)后風險模型。根據(jù)風險得分中值將訓練組的患者分為低風險組和高風險組，使用Kaplan-Meier計算高低風險組患者之間的生存差異。使用R軟件包survival 受試者工作特征(ROC)曲線計算模型1年、3年和5年的曲線下面積(AUC)。將訓練組構(gòu)建的預(yù)后風險模型納入驗證組進行驗證，并計算高低風險組患者之間生存差異和模型1年、3年和5年的AUC。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌差異表達miRNA篩選 共發(fā)現(xiàn)269個差異表達的miRNA，其中204個miRNA表達上調(diào)，65個miRNA表達下調(diào)。

2.2乳腺癌總體生存相關(guān)miRNA篩選 單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，35個miRNA與乳腺癌總體生存相關(guān)。進一步通過LASSO回歸分析發(fā)現(xiàn)，以最小λ值作為篩選準則，篩選出18個miRNA與乳腺癌患者總體生存相關(guān)。逐步多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，8個miRNA(hsa-miR-3923、hsa-miR-105-2、hsa-miR-3927、hsa-miR-449c、hsa-miR-106a、hsa-miR-1262、hsa-miR-605和hsa-miR-3929)與乳腺癌患者總體生存情況相關(guān)。

2.3乳腺癌miRNA預(yù)后風險模型的構(gòu)建 基于逐步多因素Cox回歸分析篩選出的8個miRNA，將每個miRNA的多因素Cox回歸系數(shù)和每個miRNA的表達值構(gòu)建了1個由8個miRNA組成的風險評分模型：風險得分=0.361×hsa-miR-3923+0.097×hsa-miR-105-2+0.724×hsa-miR-3927-0.333×hsa-miR-449c-0.232×hsa-miR-106a-0.366×hsa-miR-1262+0.288×hsa-miR-605+0.979×hsa-miR-3929，根據(jù)風險得分中位值將訓練組患者分為高低風險兩組(圖1A)，結(jié)果顯示，高風險組患者的總體生存率明顯低于低風險組患者(P<0.001)；ROC曲線分析顯示，風險模型1年、3年和5年的AUC分別為0.779、0.688和0.728(圖1B)。

注：A為訓練組高低風險組Kaplan-Meier生存曲線;B為訓練組采用ROC曲線評估預(yù)測模型1年、3年和5年的預(yù)測效能。

2.4乳腺癌miRNA預(yù)后風險模型的驗證 在驗證組中低風險組患者的總體生存率顯著高于高風險組(P<0.05,圖2A)，風險模型1年、3年和5年的AUC分別為0.777、0.768和0.806(圖2B)。

注：A為驗證組高低風險組Kaplan-Meier生存曲線;B為驗證組采用ROC曲線評估預(yù)測模型1年、3年和5年的預(yù)測效能。

3 討 論

目前，越來越多的研究表明，差異表達的miRNA與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可作為乳腺癌診斷、預(yù)后判斷和治療的潛在生物標志物[9-10]。與單個生物標志物相比，多個生物標志物的綜合判別可以提高預(yù)測準確性。本研究先后通過單因素Cox、LASSO回歸和多因素Cox比例風險回歸，確定了8個miRNA(hsa-miR-3923、hsa-miR-105-2、hsa-miR-3927、hsa-miR-449c、hsa-miR-106a、hsa-miR-1262、hsa-miR-605和hsa-miR-3929)可作為乳腺癌獨立的預(yù)后預(yù)測指標。然后，根據(jù)它們的表達譜和回歸系數(shù)構(gòu)建了一個由8個miRNA組成的風險模型，并用于預(yù)測乳腺癌患者的總體生存率。為了明確所構(gòu)建模型預(yù)后預(yù)測價值的可靠性，本研究設(shè)置了訓練組和驗證組兩個獨立的研究隊列。在訓練組中，根據(jù)患者的風險評分將患者分為高風險組和低風險組，Kaplan-Meier生存曲線表明兩組患者的總體生存率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，高風險組患者的總體生存率明顯低于低風險組患者。ROC曲線分析顯示，miRNA模型在預(yù)測乳腺癌患者存活風險方面具有較高的預(yù)測準確性，可作為預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的可靠生物標志物。

在既往的研究中，研究者主要通過單個基因和通路的分析探究miRNA作為乳腺癌或其他腫瘤的生物標志物的價值[11-12]。例如，LI等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-106b-5p和miR-93-5p在乳腺癌細胞中表達水平增高，其高表達可抑制抑癌基因PTEN的表達水平，從而促進乳腺癌細胞的遷移、侵襲和增殖，同時增強乳腺癌細胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑的活性；ZHAO等[12]通過多變量分析發(fā)現(xiàn)，miR-106a是膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)患者總體生存的獨立預(yù)后生物標志物，可用于預(yù)測單個GBM患者的預(yù)后和治療反應(yīng)。BERTOLI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與單個miRNA相比，循環(huán)體液中多個miRNA圖譜顯示出更好的診斷和預(yù)后預(yù)測性能以及更高的靈敏度。因此，多基因多模型綜合分析在腫瘤診斷和治療中顯得尤為重要。

近年來，亦有研究者將多基因綜合分析用于腫瘤診斷和預(yù)后分析。WANG等[14]通過TCGA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了由4個miRNA(hsa-miR-126，hsa-miR-3613，hsa-miR-424和hsa-miR-4772)組成的用于預(yù)測胰腺腺癌(PAAD)總體生存率的模型，該模型2年生存率AUC為0.789，其可作為預(yù)測PAAD患者生存的有效獨立預(yù)后生物標志物。SIRIWARDHANA等[15]采用單因素Cox和逐步多因素Cox回歸篩選出5個miRNA(miR-375，miR-582-3p，miR-326，miR-181c-5p和miR-99a-5p)用于肺腺癌預(yù)后模型的構(gòu)建，其模型可作為預(yù)測肺腺癌預(yù)后的可靠工具。最近，LUO等[16]采用LASSO Cox的方法篩選出包括miR130b，miR-18a和miR-223在內(nèi)的3個miRNA。根據(jù)3個miRNA特征性危險評分的最佳臨界值，將所有患者分為高危組和低危組。兩組患者的生存率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)，并且3個miRNA標志物具有良好的預(yù)后預(yù)測準確性，可作為腎透明細胞癌獨立的預(yù)后預(yù)測因素。這些結(jié)果表明，多基因模型的構(gòu)建在腫瘤預(yù)后的預(yù)測準確性方面具有重要意義。

盡管本研究構(gòu)建了由8個miRNA組合的預(yù)后分子標志物，其在乳腺癌預(yù)后預(yù)測中具有良好的準確性和可靠性，顯示了其可作為乳腺癌預(yù)后生物標志物的巨大潛能，但也存在一些局限性。首先，雖然本研究設(shè)置了驗證組以驗證所構(gòu)建模型的可靠性，但沒有進行臨床試驗；第二，本研究所構(gòu)建的預(yù)后風險模型雖然能夠明顯區(qū)分高低風險組，但1年、3年和5年風險得分的AUC僅能達到75%左右，其預(yù)測效能欠佳。后續(xù)研究將進一步納入該8個miRNA進行臨床驗證，同時納入其他數(shù)據(jù)庫進行功能分析和探究。

綜上所述，本研究構(gòu)建了1個由8個miRNA組成的與乳腺癌患者總體生存顯著相關(guān)的預(yù)測模型，可以從高預(yù)后風險的患者中準確識別出低預(yù)后風險的患者，并在驗證組中評估了該模型的準確性和可靠性。這些結(jié)果表明，整合的8個miRNA組合可以作為預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的潛在標志物。