王波金雯周健坤曹立宇

（1.銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)護(hù)理系，安徽 銅陵 244061；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，安徽 合肥 230021）

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）屬全球高發(fā)性惡性腫瘤，病死率位居惡性腫瘤第二位［1］，其早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后生存的關(guān)鍵.研究指出，HCC患者中能夠在早期接受有效治療的僅占30%～40%，而針對(duì)HCC 早期診斷的臨床腫瘤標(biāo)記物欠缺敏感性和多樣性［2］.HCC 早期診斷及治療的研究一直以來是科學(xué)家們的焦點(diǎn)，因此尋找具有靈敏且特異性強(qiáng)的肝癌目標(biāo)基因，實(shí)現(xiàn)早期診療、提高預(yù)后顯得尤為迫切和重要.近年來，長鏈非偏碼RNA（Long non-coding RNA，Lnc RNA）已成為惡性腫瘤生物學(xué)行為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)基因.諸多研究顯示［3-5］，Lnc RNA可參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞周期、介導(dǎo)信號(hào)調(diào)控、影響腫瘤耐藥和微血管生成等，而不同的Lnc RNA在各種臟器或組織中呈特異性表達(dá).本研究旨在觀察并探討Lnc RNA家族新成員CTC-459F4.3表達(dá)下調(diào)對(duì)HCC干性增殖及凋亡的影響，以期為HCC的有效診治提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料來源

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于ATCC細(xì)胞庫.

1.2 主要試劑與儀器

CTC-459F4.3 shRNA 慢病毒質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P）；DMEM、RPMI 1640、PBS，pH7.4（Gibco，公司）；胎牛血清（Bio IND，04-002-1A）；Antibiotic-Antimycotic、Trypsin-EDTA（0.05%）、牛血清白蛋白（Lifetechnologies）；PI-Annexin V 試劑盒（日本同仁化學(xué)，AD10）；酶標(biāo)儀（BioTek，EPOCH）；流式細(xì)胞儀（ACEN，NovoCyte）等.

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞系置于10%胎牛血清，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，相對(duì)濕度90%.0.125%胰蛋白酶作用后，培養(yǎng)基輕洗1次.加入DMEM/RPMI 1640培養(yǎng)基5mL，反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，1：2分瓶置于25mL培養(yǎng)瓶中.于對(duì)數(shù)期接種于6孔板中，每孔滴入一定滴度的慢病毒轉(zhuǎn)染48h，收集并觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率.

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)CTC-459F4.3mRNA表達(dá)

分別設(shè)CTC-459F4.3 敲低組、對(duì)照組、空質(zhì)粒組.600μl BufferRL 滴入細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打，裂解、離心后，收集mRNA溶液.分光光度計(jì)定量提取10ug估算總量，超低溫保存.按照cDNA反轉(zhuǎn)錄說明書配置反應(yīng)體系，行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn).50℃，2min；95℃，10min；40循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.采用2-ΔΔCt法計(jì)算CTC-459F4.3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量.引物序列由華大基因合成，Primer3 軟件設(shè)計(jì)如下：CTC459F4.3-F：TGCCCCTGGTCCCCTTGTCG；CTC459F4.3-R：TCTGCTGGCCTTGTCTGGCG.

1.3.3 肝癌瘤球成形實(shí)驗(yàn)

將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化后離心，去除含血清培養(yǎng)基，PBS清洗兩次；用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù).選擇超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔500-5000個(gè)細(xì)胞，補(bǔ)加培養(yǎng)基，10d左右完成培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.觀察細(xì)胞成球計(jì)數(shù)并拍照.

1.3.4 流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞分別1000rpm離心5min；用1×Annexin V Binding Solution 調(diào)整細(xì)胞密度到1×106/mL的懸液；取100ul 細(xì)胞懸液，加入5ul 的AnnexinV-FITC 結(jié)合物，再加入5ul PI solution；室溫避光15min；加入400ul 1×Annexin V Binding Solution，1h內(nèi)上機(jī)行細(xì)胞凋亡測(cè)定.

1.3.5 Western-Blot檢測(cè)

提取目標(biāo)基因總蛋白，SDS－PAGE 電泳1.5h，4%濃縮膠電流為25mA，12%分離膠電流為30mA.400mA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移0.5h、1%BSA封閉40min；一抗4℃孵育過夜；二抗孵育37℃1h；PBS清洗3次.ECL顯色、熒光拍照，凝膠圖像系統(tǒng)分析灰度值.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CTC-459F4.3 shRNA轉(zhuǎn)染效率判定

CTC-459F4.3 敲低組、對(duì)照組、空質(zhì)粒組CTC-459F 4.3mRNA 表達(dá)量分別為：0.376±0.032、0.746±0.0492、0.716±0.011；組間比較發(fā)現(xiàn)，敲低組CTC-459F4.3mRNA表達(dá)量與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較均有顯著差異（F=105.408，P<0.001）；對(duì)照組CTC-459F4.3mRNA 表達(dá)量與空質(zhì)粒組比較無差異（P=0.330）.

2.2 Western-Blot檢測(cè)結(jié)果

Western-Blot 灰度分析顯示，CTC-459F4.3 敲低組、對(duì)照組、空質(zhì)粒組SOX2 相對(duì)表達(dá)量分別為6.041±0.070、1.234±0.081、1.221±0.096，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3370.154，P<0.001）；敲低組與對(duì)照組、空質(zhì)粒組相比有差異（P<0.001），對(duì)照組與空質(zhì)粒組相比無差異（P=0.850）.4-OCT 相對(duì)表達(dá)量分別為5.849±0.575、1.321±0.027、1.463±0.059 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=178.251，P<0.001），敲低組與對(duì)照組、空質(zhì)粒組相比有差異（P<0.001），對(duì)照組與空質(zhì)粒組相比無差異（P=0.620），見圖1.

圖1 注：a：各組SOX2和4-OCT Western-Blot灰度圖；b：各組SOX2和4-OCT相對(duì)表達(dá)量

2.3 肝癌瘤球成形實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CTC-459F4.3 敲低組、對(duì)照組、空質(zhì)粒組瘤球成球數(shù)依次為32.583±3.502、8.417±0.996、9.333±1.775.敲低組瘤球成球數(shù)顯著高于對(duì)照組、空質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=411.515，P<0.001）；對(duì)照組與空質(zhì)粒組細(xì)胞瘤球成球數(shù)相比無明顯差異（P=0.301）.見圖2

圖2 a：CTC-459F4.3基因敲除組；b：對(duì)照組；c：空質(zhì)粒組；d：各組細(xì)胞成球數(shù)結(jié)果

2.4 流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

CTC-459F4.3 敲低組、對(duì)照組、空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率依次為（4.063±0.017）%、（7.980±0.064）%、（8.013±0.030）%.敲低組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=88.704，P<0.001）；對(duì)照組與空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率相比無明顯差異（P=0.925）.見圖3

圖3 a：CTC-459F4.3基因敲除組；b：對(duì)照組；c：空質(zhì)粒組；d：各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果

3 討論

肝癌干細(xì)胞（Liver Cancer Stem Cell，LCSCs）作為母源性腫瘤細(xì)胞存在于HCC 之中，具有強(qiáng)大的自我更新和分化功能，在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用.Lnc RNAs 的異常表達(dá)在LCSCs 生物學(xué)活動(dòng)中充當(dāng)重要角色，劉晨等［6］認(rèn)為LCSCs是肝癌的起源，LncRNA NEAT1高表達(dá)可能通過活化Hippo信號(hào)通路進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了LCSCs 擴(kuò)增與自我更新的促進(jìn). LncRNA KCNQ1OT1 可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mi?croR-NA-504 促進(jìn)HCC 的增殖［7］.LncRNA CTC-459F4.3 為新近發(fā)現(xiàn)的基因，有關(guān)其與肝癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的報(bào)道并不多見，有研究顯示，LncRNA RNA CTC-459F4.3過表達(dá)可通過上調(diào)CTDSPL抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，但具體機(jī)制并未闡明［8］.LncRNA RNA CTC-459F4.3更多地被應(yīng)用于基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析中的協(xié)同作用，一項(xiàng)肺腺癌的基因譜網(wǎng)絡(luò)分析研究發(fā)現(xiàn)其為核心因子之一，可參與調(diào)控多種其它基因［9］.

SOX2和OCT4是多能性干細(xì)胞調(diào)控因子，它們?cè)谂咛グl(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞自我更新以及增殖等功能，是腫瘤干細(xì)胞特性的重要分子標(biāo)記物.SOX2可通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路影響胃癌的進(jìn)展［10］.Oct4高表達(dá)可增強(qiáng)惡性腫瘤細(xì)胞的自我更新和分化能力與CRC患者的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］.血管生成是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性之一，與癌細(xì)胞干性增殖關(guān)系密切［12］，也是惡性腫瘤靶向治療的重要路徑之一.Oct4在LCSCs血管生成中起到至關(guān)重要的作用，具體機(jī)制可能為通過介導(dǎo)AKT-NF-kB-p65信號(hào)軸實(shí)現(xiàn)的［13］.在SOX2與OCT4結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，OCT4/Lys-151和SOX2/Asp-107可形成明顯的鹽橋結(jié)構(gòu)，其在蛋白修飾以及殘基突變中可以影響腫瘤細(xì)胞干性特征的穩(wěn)定性［14］.可見，SOX2和OCT4在腫瘤進(jìn)展過程中扮演了重要角色，為此，本研究采用West?ern-Blot技術(shù)檢測(cè)2個(gè)基因的表達(dá)水平，以進(jìn)一步探討LncRNA RNA CTC-459F4.3調(diào)低后對(duì)HCC干性能力的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTC-459F4.3shRNA 慢病毒質(zhì)?？沙晒D(zhuǎn)染并構(gòu)建CTC-459F4.3 低表達(dá)的HepG2 肝癌細(xì)胞系；CTC-459F4.3 調(diào)低后，SOX2 和OCT4 相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.001），提示CTC-459F4.3可能以直接或間接的方式參與了SOX2和OCT4表達(dá)水平的調(diào)控從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HCC細(xì)胞的干性能力的影響.為進(jìn)一步明確CTC-459F4.3調(diào)低后對(duì)HCC的生物學(xué)活動(dòng)作用，肝癌瘤球成形實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTC-459F4.3 調(diào)低組的肝癌細(xì)胞的聚集和增殖能力顯著增強(qiáng)；流式技術(shù)檢測(cè)顯示，CTC-459F4.3 調(diào)低組的肝癌細(xì)胞凋亡率下降. 基于上述推測(cè)，調(diào)低CTC-459F4.3 可通過SOX2 和OCT4增強(qiáng)HCC細(xì)胞的干性能力獲得，并可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性增殖和細(xì)胞凋亡抑制，在肝癌進(jìn)展中可能起到了負(fù)性調(diào)控作用，這與張軍等［8］的研究結(jié)果一致.癌細(xì)胞的干性能力與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)性，LCSCs可能是HCC耐藥、高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的源頭［15-16］.CSCs可能促成了腫瘤細(xì)胞向成熟腫瘤細(xì)胞分化過程中的耐藥突變以及耐藥維持［17］.上述提示，針對(duì)LCSCs進(jìn)一步研究CTC-459F4.3的作用，可能為HCC的早期診斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移防治及抗腫瘤耐藥等方面提供新的思路.

綜上，CTC-459F4.3表達(dá)調(diào)低可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞干性增殖、抑制其凋亡，有望成為肝癌診治的新靶點(diǎn).而該基因與肝癌進(jìn)展關(guān)系的詳細(xì)機(jī)制目前尚不明確，仍需進(jìn)一步研究.