朱 宏 鄭雪麗 黃寶生 王穎超 燕麗紅

（1.河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院；2.河西學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

據(jù)統(tǒng)計，肝細胞肝癌（Hepatocellular carcnoma，HCC）病死率居所有癌癥相關(guān)死亡的第2 位，嚴重威脅患者生命安全，給予HCC 患者及時有效治療尤為重要［1-2］. 目前經(jīng)皮肝動脈化療栓塞術(shù)（Transcatheter hepatic arterial chemoembolization，TACE）在HCC 患者中應(yīng)用價值受到臨床醫(yī)師廣泛認可，但對其療效評估方面存在一定爭議［3］.磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）是評估TACE療效的影像學(xué)手段之一，但其多依賴于腫瘤形態(tài)學(xué)改變評估療效，具有一定局限性.而磁共振灌注成像（MRI-perfusion weighted imaging，MRI-PWI）通過灌注參數(shù)值進行定量分析，能有效彌補MRI不足.可溶性Fas（Soluble Fas，sFas）是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，在HCC患者中呈過表達［4］.新近研究表明，微小RNA-224（microRNA-224，miR-224）可促進肝癌細胞增殖、遷移、侵襲，并抑制其凋亡［5］，但關(guān)于其與HCC患者療效、生存狀況關(guān)系尚需進一步探究.鑒于此，本研究選取89例HCC患者，觀察MRI-PWI參數(shù)、sFas、miR-224含量變化，分析其與療效、短期生存狀況關(guān)系，以期為臨床確定治療措施提供依據(jù).

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018 年1 月～2019 年10 月我院89 例HCC 患者作為研究對象，（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《內(nèi)科學(xué)》HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，結(jié)合病理檢查確診；年齡18～80歲；Child-Puch分級B級、C級；均成功施行TACE；生存周期＞12周；患者及家屬知曉并簽署同意書；（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：其他惡性腫瘤者；心腦血管疾病者；入組前4周接受免疫制劑治療者；MRI-PWI不耐受者.其中男48例，女41例；年齡18～80歲，平均（49.11±13.89）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）18～25 kg/m2，平均（21.56±1.38）kg/m2；腫瘤數(shù)目：38例≥2個，51例＜2個；腫瘤直徑：35例≥5cm，54例＜5cm；分化程度：37例中高分化，52例低分化；Child-Puch 分級：49 例B 級，40 例C 級；微血管浸潤：37 例有，52 例無；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：35例有，54例無.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn).

1.2 方法

1.2.1 MRI-PWI 檢測 檢查前，禁食12h，仰臥位，叮囑受檢者胸式呼吸，應(yīng)用GE Discovery MR 750 3.0 T MR掃描儀及8通道體部相控陣線圈，先行常規(guī)軸位T1WI、T2WI掃描，隨后經(jīng)高壓注射液于肘前靜脈團注對比劑扎噴酸葡胺注射液，劑量0.2mmol/kg，速度4ml/s，同時追加20ml生理鹽水，更換至PWI模式，定位像為屏氣冠狀位T1WI，使用body線圈，快速擾相GRE序列，TE1.3ms，TR5.3ms，矩陣256×256，F(xiàn)OV34×26，層厚8.0mm，NEX1.0，間隔2.0mm，掃描時間3min，每3s進行1 次全肝采集.所得原始圖像上傳至AW4.3 工作站，以相關(guān)軟件處理，選取病灶橫截面積最大、信號最強的層面繪制感興趣區(qū)（ROI），獲得容積轉(zhuǎn)運常數(shù)（Ktrans）、血管外細胞外間隙容積比（Vc），所有數(shù)據(jù)連續(xù)測量3次，取均值.由2名高年資醫(yī)師盲法判斷，意見不統(tǒng)一時，請教上級醫(yī)師，得出統(tǒng)一結(jié)論.

1.2.2 血清指標(biāo)檢測 （1）標(biāo)本采集：清晨8：30～9：30，抽取4ml 外周靜脈血，分為兩份（各2 ml），靜置20min，以2500r/min速度離心15min，取上清液，-70℃保存?zhèn)溆?（2）sFas：應(yīng)用全自動生化分析儀（日本日立公司，HITACHI7180型），以雙抗體酶聯(lián)免疫法測定血清sFas水平.由我院檢驗科醫(yī)師完全參照試劑盒說明書操作.（2）miR-224：取2ml 血清標(biāo)本，參照德國Qiagen 公司提供miRNeasy 血清試劑盒提取總RNA，RNA 質(zhì)量以分光光度計評估，所有洗脫RNA 樣品經(jīng)DNA 酶Ⅰ（Sigma）處理；以miScriptⅡRT 試劑盒（Aiagen）逆轉(zhuǎn)錄成熟miRNA，參照Applied Biosystem 7500 實時RCP系統(tǒng)進行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QRT-PCR），反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃20s，60℃30s，60℃34s，共35～40 個循環(huán)反應(yīng)，miR-224 引物：s：5，-GTCGTATC?CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAAACG-3，as：5，-CGCAAGTCCTAGTG?GTTCCG-3，；U6引物：s：5，-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，，as：5，-AACGCTTCACGAATTTGC?GT-3，，上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成，每個miRNA的相對表達量用2-△△Ct表示，△△Ct=（CtHCC-miR224-CtHCC-u6）-（CtNC-miR224-ctNC-u6），每個樣本重復(fù)3次試驗.

1.2.3 治療方法 所有患者均行TACE，利多卡因（濃度2%）局麻，Terumo股動脈專用套管針進行一次性穿刺，置入5F動脈鞘管，先行腹腔動脈、肝總動脈及腸系膜上動脈常規(guī)造影，確定腫瘤大小、部位、血供，自腫瘤供血血管注入25mg吡柔比星+700mg氟尿嘧啶，同時將10mg吡柔比星與2 ml碘化油混合液與一定量明膠海綿顆粒栓塞靶動脈，每月1次，連用2次，術(shù)后常規(guī)給予保肝、抗生素、止痛等藥物.

1.3 療效評價

參照實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)評估，完全緩解（CR）：目標(biāo)病灶動脈期增強顯影消失；部分緩解（PR）：目標(biāo)病灶直徑總和縮小30%及以上；疾病穩(wěn)定（SD）：目標(biāo)病灶直徑總和縮小29%及以下；疾病進展（PD）：目標(biāo)病灶直徑總和增大20%及以上，或出現(xiàn)新病灶.將CR、PR、SD 歸入穩(wěn)定，PD歸入進展.

1.4 觀察指標(biāo)

（1）HCC患者治療前、治療后4周MRI-PWI參數(shù)、血清sFas、miR-224水平.（2）不同療效患者治療前、治療后4周MRI-PWI參數(shù)、血清sFas、miR-224水平.（3）不同生存狀況治療前、治療后4周患者MRI-PWI 參數(shù)、血清sFas、miR-224水平.（4）MRI-PWI參數(shù)、血清sFas、miR-224水平單一或聯(lián)合預(yù)測HCC死亡價值.（5）MRI-PWI參數(shù)、血清sFas、miR-224水平與HCC患者死亡關(guān)系.

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 治療前后各指標(biāo)

89例HCC患者治療后4周miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于治療前（P＜0.05）.見表1.

表1 治療前后各指標(biāo)（±s）

表1 治療前后各指標(biāo)（±s）

時間治療前治療后4周n 89 89 t P Ktrans（min）1.36±0.25 0.42±0.11 32.468＜0.001 Vc（%）0.55±0.19 0.41±0.07 6.523＜0.001 sFas（μg/L）5.32±1.28 2.40±0.31 20.917＜0.001 miR-224 3.66±1.02 1.47±0.53 17.974＜0.001

2.2 進展及穩(wěn)定患者治療前后各指標(biāo)

治療前進展及穩(wěn)定患者sFas、miR-224、Vc、Ktrans比較，無顯著差異（P＞0.05），治療后4周穩(wěn)定患者miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于進展患者（P＜0.05）.見表2.

表2 進展及穩(wěn)定患者治療前后各指標(biāo)（±s）

表2 進展及穩(wěn)定患者治療前后各指標(biāo)（±s）

時間n治療前組別穩(wěn)定進展40 49 tP穩(wěn)定治療后4周進展40 49 tP Ktrans（min）1.37±0.26 1.35±0.28 0.331 0.742 0.31±0.10 0.51±0.21 5.530＜0.001 Vc（%）0.56±0.17 0.54±0.18 0.535 0.594 0.27±0.06 0.52±0.12 11.999＜0.001 sFas（μg/L）5.34±1.25 5.30±1.28 0.141 0.888 2.23±0.28 2.61±0.34 5.783＜0.001 miR-224 3.67±1.01 3.65±1.04 0.091 0.927 1.30±0.48 1.61±0.57 2.737 0.007

2.3 生存及死亡患者各指標(biāo)

治療后隨訪12 周，發(fā)現(xiàn)12 例死亡，77 例生存.治療前生存及死亡患者sFas、miR-224、Vc、Ktrans比較，無顯著差異（P＞0.05），治療后4周生存患者miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于死亡患者（P＜0.05）.見表3.

表3 生存及死亡患者治療前后各指標(biāo)（±s）

表3 生存及死亡患者治療前后各指標(biāo)（±s）

時間n治療前組別生存死亡77 12 t P生存治療后4周死亡77 12 t P Ktrans（min）1.35±0.29 1.42±0.22 0.799 0.426 0.33±0.10 1.00±0.31 14.938＜0.001 Vc（%）0.54±0.21 0.61±0.14 11.114 0.268 0.30±0.09 1.12±0.35 2.830 0.006 sFas（μg/L）5.31±1.58 5.38±1.54 0.143 0.886 2.21±0.66 3.62±1.08 6.252＜0.001 miR-224 3.65±1.13 3.72±1.01 0.202 0.840 1.32±0.40 2.43±0.73 7.858＜0.001

2.4 單一及聯(lián)合預(yù)測HCC患者死亡價值

ROC 顯示，聯(lián)合預(yù)測HCC 患者死亡價值的AUC 為0.881（95%CI：0.795～0.940），診斷敏感度及特異度分別為83.33%、89.61%，其次為Ktrans 0.827（0.733～0.899）、Vc 0.811（0.714～0.886）、miR-224 0.805（0.708～0.882）、sFas 0.797（0.699～0.875）.見表4，圖1～2.

圖1 單一預(yù)測HCC患者死亡價值

表4 單一及聯(lián)合預(yù)測HCC患者死亡價值

圖2 聯(lián)合預(yù)測HCC患者死亡價值

2.5 各指標(biāo)與生存狀況關(guān)系

根據(jù)ROC分析sFas、miR-224、Vc、Ktrans最佳截斷值分為高危組和低危組.KM曲線顯示，sFas、miR-224、Vc、Ktrans 高危組生存率低于低危組（χ2分別為8.667、6.489、4.680、6.782，P＜0.05）.見圖3～6.

圖3 sFas與生存狀況關(guān)系

圖4 miR-224與生存狀況關(guān)系

圖5 Vc與生存狀況關(guān)系

圖6 Ktrans與生存狀況關(guān)系

2.6 logistic回歸分析影響HCC患者死亡因素

以HCC患者是否死亡作為因變量，分化程度、腫瘤直徑、Child-Pugh 分級、腫瘤數(shù)目、微血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、sFas、miR-224、Vc、Ktrans 作為自變量納入logistic 回歸模型，結(jié)果顯示，低分化程度、腫瘤直徑≥5cm、腫瘤數(shù)目≥2個、Child-Pugh 分級C級、微血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、sFas≤2.50μg/L、miR-224＞2.06、Vc＞0.82%、Ktrans＞1.01min是影響HCC患者死亡危險因素（P＜0.05）.見表5.

表5 logistic回歸分析影響HCC患者死亡因素

3 討論

HCC是惡性程度最高腫瘤性疾病，易于復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，因而臨床治療效果差，病死率高［7］.發(fā)病初期，HCC 患者無特異性臨床表現(xiàn)，確診時已屬中晚期，需采取TACE 等介入治療.TACE 作用機制是將抗癌藥物直接作用于病變部位，殺傷腫瘤細胞，結(jié)合栓塞可影響腫瘤細胞血供，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，但其無法完全殺傷腫瘤細胞，需行多次TACE，特別是瘤體巨大者［8-9］.如何客觀評價TACE療效，了解TACE介入術(shù)后腫瘤壞死程度，對臨床調(diào)整治療方案具有積極意義.

目前，TACE的療效判斷主要依賴于MRI，但常規(guī)肝臟MRI檢查序列多局限于形態(tài)學(xué)，隨醫(yī)學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，影像醫(yī)學(xué)正從單純形態(tài)學(xué)逐步向形態(tài)學(xué)結(jié)合反映細胞、分子水平生理生化改變的功能學(xué)檢查發(fā)展［10-11］.PWI可無創(chuàng)性反映組織血管化程度及血流灌注情況，量化分析組織及腫瘤血管動力學(xué)方面信息，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉骨關(guān)節(jié)系統(tǒng).傳統(tǒng)觀念認為，PWI易受脈搏、呼吸、腸道蠕動等因素影響，難以在肝臟、胃等腹部臟器廣泛應(yīng)用［12］.近年隨磁共振快速及超快速成像序列開發(fā)及應(yīng)用，成像時間、信噪比得到明顯改善，腹部磁共振灌注成像質(zhì)量得到明顯提高，對實現(xiàn)磁共振肝臟灌注成像提供有利依據(jù).本研究給予89例接受TACE 的HCC患者MRI-PWI檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后4周Ktrans低于治療前，且穩(wěn)定患者Ktrans低于進展患者（P＜0.05），與朱正［13］研究結(jié)果相符，提示Ktrans值越低，HCC患者TACE療效越好.Vc是對比劑在組織血管外細胞外間隙所占容積比，資料顯示，惡性腫瘤Vc值高于正常組織，并指出對TACE治療有效的腫瘤組織Vc值會降低［14］，究其原因在于，TACE 治療后，腫瘤血供受化療藥物、碘油填充破壞較大，壞死較徹底，腫瘤體積縮小更為明顯，Ktrans 及Vc值下降越明顯.本研究隨訪12周發(fā)現(xiàn)，生存患者Vc、Ktrans 低于死亡患者（P＜0.05），說明Vc、Ktrans 升高可能與HCC 患者生存狀況有關(guān).ROC 顯示，Vc、Ktrans 升高可作為HCC 患者死亡預(yù)測指標(biāo)之一. logistic 回歸分析顯示，Vc＞0.82%、Ktrans＞1.01min為患者死亡的獨立危險因素，提示MRI-PWI 參數(shù)升高會增加HCC 患者死亡風(fēng)險，需及時給予相應(yīng)治療.

HCC發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡密切相關(guān)，而sFas可能是肝癌細胞凋亡途徑之一［15］.sFas可結(jié)合sFas配體，刺激半胱天冬蛋白酶，導(dǎo)致細胞發(fā)生蛋白水解，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡.亦有研究表明，原發(fā)性肝癌患者血中sFas水平高于健康體檢者［16］.sFas可抑制FasL誘導(dǎo)的淋巴細胞凋亡，增加體內(nèi)激活淋巴細胞數(shù)量，參與原發(fā)性肝癌病理過程.魯玉娟等［17］研究指出，香菇多糖聯(lián)合TACE可降低原發(fā)性肝癌患者sFas水平.但目前關(guān)于HCC患者經(jīng)TACE治療后sFas水平變化研究較少，故本研究對此進行分析，發(fā)現(xiàn)治療4周后血清sFas水平低于治療前，且穩(wěn)定患者低于進展患者，可能與TACE治療后腫瘤病灶肝動脈及門靜脈供血得到治療有關(guān)，亦從側(cè)面反映高sFas 可能與HCC 患者TACE 治療療效有關(guān).本研究還發(fā)現(xiàn)，治療4 周后生存患者sFas 低于死亡患者（P＜0.05），說明HCC 患者sFas持續(xù)升高會導(dǎo)致淋巴細胞凋亡延遲，加劇肝組織損傷，進而導(dǎo)致患者死亡.ROC 顯示，sFas 預(yù)測HCC 患者死亡價值的AUC 為0.797.logistic 回歸分析顯示，sFas 是HCC 患者死亡的獨立危險因素.上述結(jié)果均說明sFas水平越高，HCC患者死亡風(fēng)險越大，建議臨床及時采取治療措施，以降低死亡率.

近年miR-224與腫瘤形成、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究熱點領(lǐng)域.相關(guān)研究指出，血清miR-224 在HCC 患者中平均表達量約為健康人的10 倍，推測是由于肝癌組織中高表達的miR-224 以一定方式釋放入外周血所致［18］.亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，血清miR-224 濃度與肝癌組織濃度呈正相關(guān)，手術(shù)切除腫瘤組織后，其濃度明顯下降［19-20］.上述結(jié)果提示HCC患者血清miR-224濃度升高可能與腫瘤組織有關(guān)，但其釋放機制尚未清晰.本研究結(jié)果顯示，89例HCC患者治療后4周miR-224低于治療前，且穩(wěn)定患者低于進展患者（P＜0.05），可能與TACE能縮小腫瘤體積，降低血清miR-224 水平有關(guān)，同時說明miR-224 有望成為評估TACE 療效的生物學(xué)標(biāo)志物之一.另有研究報道，血清miR-224 與HCC 患者臨床分期、病理分化程度密切相關(guān)，可增加腫瘤侵襲性，引起腫瘤轉(zhuǎn)移，加劇病情進展，降低患者生存率［21］.本研究還發(fā)現(xiàn)，治療后4周生存患者miR-224低于死亡患者（P＜0.05），說明miR-224對HCC患者死亡具有一定預(yù)測價值.同時多因素回歸分析顯示，miR-224 是HCC 患者死亡獨立危險因素，有助于臨床醫(yī)師早期預(yù)測死亡風(fēng)險，確定合理治療方案.此外，ROC 曲線顯示，聯(lián)合預(yù)測HCC 患者死亡價值的AUC 為0.881，提示臨床應(yīng)重視MRI-PWI 參數(shù)、sFas、miR-224聯(lián)合預(yù)測HCC死亡價值，及時調(diào)整治療方案，降低HCC患者死亡風(fēng)險.

綜上可知，HCC患者TACE治療后MRI-PWI參數(shù)、sFas、miR-224較治療前減低，聯(lián)合檢測能較好預(yù)測HCC患者生存狀況，為臨床診治提供科學(xué)依據(jù).