王 錦 馬瑋瑋 劉 燕 劉小玲 姜現(xiàn)瑞 張娟娟

（河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

支氣管哮喘（Bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘）是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，在我國哮喘的患病率呈快速上升趨勢(shì)［1］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量.中醫(yī)藥在治療哮喘方面歷史悠久，臨床經(jīng)驗(yàn)豐富.七味葡萄散（Qiwei grape powder）系蒙古族驗(yàn)方，具有清肺、止咳、定喘等功能［2］.本研究采用卵蛋白致支氣管哮喘大鼠模型，應(yīng)用七味葡萄散對(duì)哮喘模型大鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)治療，觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，并在光鏡下觀察肺部損傷的組織病理學(xué)改變，評(píng)價(jià)七味葡萄散對(duì)哮喘模型大鼠肺部損傷的影響，以進(jìn)一步探討七味葡萄散治療哮喘的作用機(jī)制.

1 材料

1.1 藥物：白葡萄干15g，石膏12.5g，香附11.5g，石榴11g，甘草9g，紅花5.5g，肉桂5.5g.制法除白葡萄干外，其余石膏等六味粉碎成粗粉，加白葡萄干，粉碎，烘干，再粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻，即得.七味葡萄散由阜新蒙藥有限責(zé)任公司提供.

1.2 動(dòng)物：Wistar大鼠，雌雄各半，體重180～220g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心購買，SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～26℃，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)編號(hào)1509005，動(dòng)物飼料也由上述單位提供.

1.3 試劑：氫氧化鋁（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、卵清蛋白OVA（sigmaA5503卵白蛋白）、水合氯醛（鄭州優(yōu)然食品化工有限公司）、多聚甲酵溶液（丹東市龍海試劑廠）.

2 方法

2.1 分組及疾病模型建立：30 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、哮喘模型組、七味葡萄散干預(yù)組［0.15g/（kg·d）］，每組10 只.哮喘模型組、七味葡萄散干預(yù)組用10%卵清蛋白（OVA）1.0ml 致敏液（致敏液由100mgOVA、100mg氫氧化鋁和800mg生理鹽水配置成1ml混懸液）進(jìn)行腹腔注射，共注射3次（第1日，第7日，第14日），第15日開始，在口鼻全相態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)備中以10%卵清蛋白霧化激發(fā)，連續(xù)激發(fā)兩周（每日一次，一次20min）.空白對(duì)照組腹腔注射1.0ml生理鹽水和生理鹽水霧化，次數(shù)及方法同其他2組.七味葡萄散干預(yù)組在每次霧化激發(fā)前30min，給予七味葡萄散（［0.15g/（kg·d）］）灌胃（藥物按人與動(dòng)物體表面積比率換算：大鼠用量=人口服總量×大鼠與人體表比）.空白對(duì)照組和哮喘模型組每次霧化激發(fā)前給與相同劑量的生理鹽水灌胃.

2.2 行為學(xué)評(píng)價(jià)：根據(jù)文獻(xiàn)［3］介紹的方法，對(duì)末次激發(fā)引喘后大鼠進(jìn)行行為學(xué)及呼吸系統(tǒng)癥狀程度的評(píng)分，用以評(píng)價(jià)大鼠癥狀表現(xiàn)程度，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：呼吸正常或僅有呼吸急促；1分：顫動(dòng)或點(diǎn)頭；2分：咳嗽或呼吸加深；3分：節(jié)律性收腹樣喘促；6分：跌倒.

2.3 取材及標(biāo)本制備：標(biāo)本制備與處理：連續(xù)14天霧化激發(fā)后，在第15天用水合氯醛在大鼠腹部進(jìn)行注射麻醉，麻醉后取右肺上葉肺組織，并置于甲醛溶液進(jìn)行固定.將固定好的肺組織采用常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察.

2.4 肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分：根據(jù)文獻(xiàn)［3］介紹的方法，采用雙盲病理評(píng)分法，對(duì)大鼠肺組織HE染色病理切片進(jìn)行肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分，即由兩位病理?？漆t(yī)生根據(jù)炎性細(xì)胞浸潤、支氣管上皮細(xì)胞脫落、肺泡間隔增厚等三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，計(jì)算總分，并根據(jù)兩位病理科醫(yī)生評(píng)分結(jié)果最后計(jì)算平均分，用以半定量評(píng)估肺組織損傷程度.支氣管上皮細(xì)胞脫落評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常（無或偶見黏膜上皮鱗狀上皮化生）；1分：輕度脫落（黏膜上皮鱗狀上皮化生，偶見上皮細(xì)胞脫落）；2分：中度脫落（黏膜上皮鱗狀上皮化生，上皮細(xì)胞部分脫落，露出固有膜）；3分：重度脫落（黏膜上皮鱗狀上皮化生，上皮細(xì)胞成片脫落，固有膜破壞）.肺泡間隔增厚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常（無肺泡間隔增厚）；1分：輕度增厚（肺泡間隔增厚至正常厚度的1～2倍）；2分：中度增厚（肺泡間隔增厚至正常厚度的3～5倍）；3分：重度增厚（肺泡間隔增厚至正常厚度的5倍以上）.炎性細(xì)胞浸潤評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常（無或偶見炎性細(xì)胞浸潤）；1分：輕度細(xì)胞浸潤（散在炎性細(xì)胞浸潤，或偶可見部分聚集成團(tuán)）；2分：中度細(xì)胞浸潤（炎性細(xì)胞聚集成團(tuán)，但尚未侵及支氣管黏膜下層）；3分：重度細(xì)胞浸潤（大量炎性細(xì)胞成團(tuán)浸潤，侵及支氣管黏膜下層甚至黏膜層）.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

4 結(jié)果

4.1 大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及評(píng)價(jià)

在霧化激發(fā)階段，空白對(duì)照組大鼠呼吸頻率均勻、毛發(fā)光滑、進(jìn)食正常.哮喘模型組大鼠均不同程度的出現(xiàn)呼吸急促、撓臉、煩躁不安、點(diǎn)頭、顫動(dòng)、咳嗽、節(jié)律性收腹樣喘促、跌倒、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少、大便稀溏、皮毛黃濕脫落無光澤等.七味葡萄散干預(yù)組上述癥狀表現(xiàn)比較輕.對(duì)末次激發(fā)引喘后各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)癥狀程度評(píng)價(jià)（如表1），與空白對(duì)照組相比，哮喘模型組和七味葡萄散干預(yù)組大鼠行為學(xué)癥狀程度評(píng)分均明顯升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）.七味葡萄散干預(yù)組與哮喘模型組相比，大鼠行為學(xué)癥狀程度評(píng)分均減少，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）.整體來看，各組大鼠行為學(xué)評(píng)分由大到小依次為：哮喘模型組>七味葡萄散干預(yù)組>空白對(duì)照組，呈逐漸遞增趨勢(shì).

表1 末次激發(fā)引喘后各組大鼠行為學(xué)癥狀程度評(píng)分表（分，±s）（n=10）

表1 末次激發(fā)引喘后各組大鼠行為學(xué)癥狀程度評(píng)分表（分，±s）（n=10）

注：與空白對(duì)照組相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與哮喘模型組相比＃P<0.05.

組別空白對(duì)照組哮喘模型組七味葡萄散干預(yù)組行為學(xué)癥狀程度評(píng)分0.300±0.152 3.600±1.776＊＊1.600±0.699＊＊＃

4.2 肺組織病理切片HE染色觀察

空白對(duì)照組：支氣管和肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔、肺間質(zhì)均未見炎癥細(xì)胞浸潤（如圖①）.極個(gè)別空白對(duì)照組肺組織HE染色切片可見肺內(nèi)可見細(xì)支氣管上皮有少量脫落，圍繞細(xì)支氣管周圍的結(jié)締組織可見淋巴細(xì)胞和少許粒細(xì)胞浸潤，肺泡間隔稍有增厚，但均屬輕度.

哮喘模型組：肺組織可見明顯的病理損傷.肺泡和支氣管結(jié)構(gòu)不完整，支氣管壁纖維組織和平滑肌細(xì)胞增生增厚，管壁水腫、粘膜上皮部分脫落，肺泡腔內(nèi)和支氣管壁可見大量炎性細(xì)胞浸潤，炎性細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡間隔明顯增厚（如圖②）.

七味葡萄散干預(yù)組：與模型組比較肺組織損傷較輕.在支氣管和血管周圍可見少量的巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞；肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡上皮細(xì)胞及肺間隔損傷較輕，毛細(xì)血管輕度充血，部分肺泡腔內(nèi)可見少量的炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞滲出；支氣管結(jié)構(gòu)基本完整，管壁結(jié)構(gòu)清晰未見明顯的纖維組織的增生和平滑肌細(xì)胞增生，氣道上皮細(xì)胞排列整齊、上皮細(xì)胞幾乎未見明顯的損傷（如圖③）.

顯微鏡下各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE染色，×200）圖①為空白對(duì)照組；圖②為哮喘模型組；圖③為七味葡萄散干預(yù)組

4.3 肺組織HE染色半定量分析

依據(jù)大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤、支氣管上皮細(xì)胞脫落、肺泡間隔增厚等方面進(jìn)行評(píng)分統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行兩兩比較（如表2）.與空白對(duì)照組相比，哮喘模型組和七味葡萄散干預(yù)組大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分均增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）.七味葡萄散干預(yù)組與哮喘模型組相比，大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分減少，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）.整體來看，各組大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分從高到低依次為：哮喘模型組>七味葡萄散干預(yù)組>空白對(duì)照組，呈逐漸遞減趨勢(shì).

表2 各組大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分表（分，±s）（n=10）

表2 各組大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分表（分，±s）（n=10）

注：與空白對(duì)照組相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與哮喘模型組相比＃P<0.05，＃＃P<0.01.

組別空白對(duì)照組哮喘模型組七味葡萄散干預(yù)組總分1.300±1.828 6.500±1.433＊＊3.900±1.197＊＊＃＃炎細(xì)胞浸潤0.600±0.843 2.400±0.516＊＊1.400±0.516＊＃＃支氣管上皮脫落0.400±0.699 2.400±0.516＊＊1.300±0.483＊＊＃＃肺泡間隔增厚0.300±0.483 1.700±0.674＊＊1.200±0.421＊＊＃

5 討論

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為氣道炎癥、氣流受限和氣道高反應(yīng)性［4］.在臨床上最常見的三個(gè)癥狀為咳嗽、胸悶和氣促［5］.目前對(duì)哮喘暫無有效的根治方法，其治療仍是以控制癥狀為主，治療藥物有吸入性糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑、抗膽堿能藥物及白三烯調(diào)節(jié)劑等，其中吸入性糖皮質(zhì)激素是治療哮喘最有效的藥物，但部分哮喘患者常規(guī)吸入糖皮質(zhì)激素治療無效［6］，且高劑量吸入激素可增加條件致病菌感染的患病率［7］.

中藥在治療哮喘上有著悠久的歷史和獨(dú)到的療效，中藥能控制氣道炎癥，延緩氣道重建，調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌，具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)［8，9］.臨床研究發(fā)現(xiàn)［10，11］七味葡萄散在治療慢性阻塞性肺疾病方面有較好的療效.七味葡萄散系蒙古族驗(yàn)方，源于《醫(yī)法海鑒》，被收入在《中華人民共和國藥典》2020年版一部，由白葡萄干、紅花、甘草、肉桂等配合組成，具有清肺、止咳、定喘等功能［2］.方中以性涼，味甘，清肺熱、止咳平喘良藥白葡萄干為主；配合以涼血益肝良藥紅花，止咳益肺良藥石膏、甘草、香附，加配以石榴、肉桂等.從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度，七味葡萄散平喘作用機(jī)制未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)利用卵清蛋白致敏和激發(fā)大鼠，建立哮喘大鼠模型并使用七味葡萄散進(jìn)行干預(yù)，觀察七味葡萄散的平喘作用及其機(jī)制.

咳嗽、胸悶和氣促是哮喘的主要癥狀，是氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑等病理改變反應(yīng)于外的表現(xiàn).減輕疾病外部表現(xiàn)是改善病理改變的必要依據(jù)，是哮喘疾病診斷和防治療效評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容［3］.本實(shí)驗(yàn)對(duì)末次激發(fā)引喘后大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，哮喘模型組和七味葡萄散干預(yù)組較空白對(duì)照組行為學(xué)程度評(píng)分均升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明本實(shí)驗(yàn)成功建立了哮喘動(dòng)物模型.七味葡萄散干預(yù)組與哮喘模型組相比，大鼠行為學(xué)癥狀程度評(píng)分減少，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明七味葡萄散可減輕哮喘哮喘模型大鼠的哮喘癥狀.

氣道炎癥是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)［8］，浸潤的炎性細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等為主［12］.本實(shí)驗(yàn)肺組織病理學(xué)顯示，哮喘模型組大鼠肺組織肺泡壁結(jié)構(gòu)受損，肺泡壁增厚，支氣管腔狹窄，黏膜上皮細(xì)胞脫落，支氣管與血管周圍重度炎性細(xì)胞浸潤，炎性細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；七味葡萄散干預(yù)后，能改善哮喘大鼠炎癥細(xì)胞浸潤、支氣管上皮細(xì)胞脫落、肺泡間隔增厚等肺組織病理損傷.大鼠肺組織損傷半定量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，哮喘模型組和七味葡萄散干預(yù)組大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分均增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.七味葡萄散干預(yù)組與哮喘模型組相比，大鼠肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.說明七味葡萄散對(duì)哮喘模型大鼠具有一定的防治作用.

綜上所述，七味葡萄散作為一種中藥制劑，在卵清蛋白誘發(fā)的哮喘模型大鼠中，具有改善哮喘模型大鼠的癥狀和減輕哮喘模型大鼠氣道病理損傷的作用，但具體的細(xì)胞學(xué)、分子學(xué)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究.