趙越超 王 珺 胡慧瑾 葉寶東

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic sydrome，MDS)是一組起源于造血干細(xì)胞的異質(zhì)性髓系克隆性的惡性腫瘤，其特征是骨髓中一系或多系無(wú)效造血，外周血細(xì)胞減少，遺傳不穩(wěn)定，并具有發(fā)展為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)的可能。MDS進(jìn)展過(guò)程是以異質(zhì)性的克隆性造血干細(xì)胞紊亂為中心，由低危MDS到高危MDS再到AML，骨髓原始細(xì)胞比例逐漸增加，是惡性克隆逐漸擴(kuò)增的過(guò)程[1]。

近年來(lái)，大量與MDS臨床表型相關(guān)的點(diǎn)突變被發(fā)現(xiàn)[2,3]。這些突變有可能反映臨床預(yù)后以及疾病進(jìn)展[4]。然而，目前MDS的免疫學(xué)因素尚不明確。但最近的臨床和分子研究已經(jīng)積累了關(guān)于不同免疫途徑在MDS發(fā)病和進(jìn)化中貢獻(xiàn)的證據(jù)[5,6]。其中細(xì)胞免疫失調(diào)在MDS發(fā)病及疾病進(jìn)展中尤為重要。因此，進(jìn)一步了解不同階段的MDS患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)，可能有助于評(píng)估疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后，并指導(dǎo)選擇有效的靶向治療。目前臨床診療中通常采用IPSS(international prognosis scoring system)以及IPSS-R(revised international prognosis scoring system)對(duì)患者進(jìn)行預(yù)后危險(xiǎn)程度評(píng)分以及分層治療。因此，本研究旨在通過(guò)分析不同IPSS-R危險(xiǎn)程度以及不同原始細(xì)胞比例的MDS患者T淋巴細(xì)胞亞群的變化，以評(píng)估不同階段MDS患者免疫狀態(tài)，為預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展提供免疫方面的預(yù)后因子，現(xiàn)報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

1.一般資料：選擇筆者醫(yī)院2017年9月～2018年11月MDS患者55例(MDS組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO診斷分型[7]，選擇同期健康供者30例作為對(duì)照組，詳見(jiàn)表1。根據(jù)IPSS-R評(píng)分系統(tǒng)將MDS患者分為低危組14例，中危組23例，高危組14例，極高危組4例;根據(jù)骨髓原始細(xì)胞百分比，再次將MDS患者分為原始細(xì)胞比例<5% 組32例以及原始細(xì)胞比例≥5%組23例。

表1 MDS組與對(duì)照組一般資料比較

2.方法：流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter公司的FC 500，所用試劑單克隆抗體(McAb)為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。將不同的20μl熒光單抗，分別加入100μl乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的新鮮外周血。避光室溫放置20min，甲酸裂解紅細(xì)胞，4℃1200r/min下離心收集細(xì)胞,棄上清,用PBS洗細(xì)胞兩次,相同條件下離心，棄上清后，細(xì)胞懸浮在500μl PBS液中，上機(jī)檢測(cè)，分析10000個(gè)細(xì)胞。采用CD45-SSC設(shè)門(mén)，ELITE4.5軟件分析數(shù)據(jù)[同時(shí)設(shè)立免疫球蛋白G(IgG)及正常人為陰性對(duì)照]。其中Treg細(xì)胞分子標(biāo)記為CD4+、CD25+、CD127low/-，NK細(xì)胞分子標(biāo)記為CD3-、CD16+、CD56+。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用Graphpad Prism(version5.02)軟件,對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

根據(jù)IPSS-R評(píng)分系統(tǒng)以及骨髓原始細(xì)胞比例這兩個(gè)層面，將55例MDS組患者進(jìn)行分組，比較各組Treg細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell)的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),越高危的MDS患者，其Treg細(xì)胞比例越高，自然殺傷(NK)細(xì)胞比例越低,IPSS-R評(píng)分系統(tǒng)中，Treg細(xì)胞的表達(dá)水平隨著危險(xiǎn)程度升高而升高，IPSS-R高危組以及極高危組與中危組、低危組、對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而NK細(xì)胞比例則相反，隨著MDS患者IPSS-R預(yù)后評(píng)分的升高，各組間自然殺傷細(xì)胞比例逐漸降低，但MDS患者各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 IPSS-R各組與對(duì)照組Treg細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)比例

原始細(xì)胞比例高的MDS患者，其Treg細(xì)胞比例較高，NK細(xì)胞比例較低，根據(jù)骨髓原始細(xì)胞百分比，<5%(n=32)、≥5%(n=23)將患者分為兩組，比較兩組患者Treg細(xì)胞以及NK細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，原始細(xì)胞比例≥5%組與原始細(xì)胞比例<5%組以及對(duì)照組比較，Treg細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，原始細(xì)胞比例≥5%組與對(duì)照組比較，NK細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但不同原始細(xì)胞比例的兩組間NK細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 不同原始細(xì)胞比例組與對(duì)照組Treg細(xì)胞及NK細(xì)胞表達(dá)比例

討 論

不同免疫細(xì)胞群對(duì)MDS的影響一直是被研究的重要發(fā)病因素。其中，Treg細(xì)胞是構(gòu)成輔助T細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群。他們不僅參與誘導(dǎo)免疫耐受，而且有助于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。多項(xiàng)研究證實(shí)Treg參與調(diào)控抗腫瘤免疫和MDS的進(jìn)展[8，9]。并且有研究表明Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量可以作為低危MDS預(yù)后因子，幫助預(yù)測(cè)貧血的嚴(yán)重報(bào)告，AML轉(zhuǎn)化率以及總體生存率[10]。隨著MDS發(fā)展到高危期和晚期，Treg細(xì)胞的擴(kuò)增可能有助于突變MDS克隆逃避適應(yīng)性免疫[11]。同時(shí)有多項(xiàng)研究指出，低危MDS患者的Tregs數(shù)量降低，而高危的MDS患者Tregs活性增強(qiáng)，并且增強(qiáng)了白血病克隆增殖[10，12，13]。另外，NK細(xì)胞在MDS免疫失調(diào)中的作用是由于NK細(xì)胞總數(shù)或功能的減少導(dǎo)致免疫監(jiān)視缺陷，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展[14]。有研究指出，MDS患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量減少且功能受損，進(jìn)而造成免疫監(jiān)測(cè)受損，導(dǎo)致疾病進(jìn)展及提示預(yù)后不良[15，16]。并且在一項(xiàng)涉及48例高危MDS患者的研究中發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒功能下降，其受損程度與代表疾病負(fù)荷的因素相關(guān)，如更高的IPSS評(píng)分，異常染色體核型以及原始細(xì)胞數(shù)[17]。盡管MDS患者通常伴有淋巴細(xì)胞減少，但細(xì)胞免疫在低危MDS中通常為上調(diào)狀態(tài)，這些患者表現(xiàn)為較高的細(xì)胞毒性(CD8+) T細(xì)胞和較低的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)[18，19]。相比之下，高危MDS患者表現(xiàn)為細(xì)胞反應(yīng)受損狀態(tài)，通常CD8+T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞水平較低，Treg細(xì)胞數(shù)量較高[20]。因此，Treg細(xì)胞及NK細(xì)胞有可能成為監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展以及提示預(yù)后不良的重要指標(biāo)。

本研究中為明確不同預(yù)后分層的MDS患者間其Treg細(xì)胞的表達(dá)水平，筆者根據(jù)IPSS-R系統(tǒng)以及骨髓原始細(xì)胞比例將55例MDS患者分組，結(jié)果呈現(xiàn)出MDS患者預(yù)后危險(xiǎn)評(píng)分越高Treg細(xì)胞比例越高的趨勢(shì)，但是IPSS-R各組間NK細(xì)胞比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從平均值上看，各組NK細(xì)胞的表達(dá)水平是有區(qū)別的，如果增加樣本量，相信兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，原始細(xì)胞比例≥5%組與原始細(xì)胞比例<5%組比較，Treg細(xì)胞比例明顯升高，而兩組間NK細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但在數(shù)值上，NK細(xì)胞表達(dá)水平仍呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。這也進(jìn)一步提示Treg細(xì)胞的升高以及NK細(xì)胞的減少可能與MDS的預(yù)后不良相關(guān)。因?yàn)閮烧呔芤鹈庖弑O(jiān)視的缺失，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展。

目前用于預(yù)測(cè)MDS預(yù)后的因素反映了骨髓發(fā)育不良克隆固有的漸進(jìn)變化，包括骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、突變、輸血依賴、細(xì)胞減少的數(shù)量、年齡和其他并發(fā)癥。新的模型，如MDAS，通過(guò)增加年齡、ECOG評(píng)分、以及血細(xì)胞計(jì)數(shù)的加權(quán)貢獻(xiàn)，成功地提高了預(yù)測(cè)精度[21～23]。然而，這些因素都不能反映可能影響疾病的免疫參數(shù)的漸進(jìn)變化[10]。然而Treg的增加以及NK細(xì)胞的減少，可能反映了活躍的免疫抑制，表明免疫抑制微環(huán)境的轉(zhuǎn)化，為疾病診治進(jìn)展提供免疫學(xué)證據(jù)。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)Treg細(xì)胞及NK細(xì)胞的變化，來(lái)監(jiān)測(cè)不同階段的MDS患者的免疫狀態(tài)，更有助于進(jìn)一步評(píng)估疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后以及疾病進(jìn)展，并指導(dǎo)選擇有效的靶向治療。