張 榮，李 寧(綜述)，楊秋云，劉廣芝(審校)

(1.河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450066；2.河南省人民醫(yī)院國際醫(yī)療中心，河南 鄭州 450003；3.河南省人民醫(yī)院干細胞研究中心，河南 鄭州 450003)

早發(fā)性卵巢功能不全是導致女性不孕的常見原因之一，其發(fā)生機制尚不明確，激素替代治療僅能緩解癥狀而不能解決患者生育力下降。雖然目前尚未獲得人類干細胞體外誘導分化的功能成熟的卵子，但在這一技術(shù)對解決女性生育力下降問題有應用潛力。將不同物種來源的干細胞誘導分化為原始生殖細胞樣細胞(primordial germ-like cells，PGCLCs)、卵泡樣細胞和卵母細胞樣細胞(oocyte-like cells，OLCs)，可以為探索卵子的發(fā)生調(diào)控機制提供可能的細胞模型，并可能成為早發(fā)性卵巢功能不全患者潛在治療手段，現(xiàn)對此領域最新進展作一綜述。

1 卵巢干細胞(Oogonial Stem Cells，OSCs)

2004年Johnson等[1]的研究指出小鼠卵泡閉鎖速度大于卵巢中非閉鎖卵泡消耗速率，認為存在卵泡更新并提出了卵巢干細胞的概念，之后關(guān)于OSCs的存在備受爭議，若可以確定OSCs的存在，其具有自然向OLCs分化的能力，易在最小的培養(yǎng)條件下獲得OLCs，可用作體外獲得OLCs的良好細胞來源。許多研究證實不同物種來源(包括人[2]、羊[3]、小鼠[4]等)的OSCs是存在的：機械法或酶消化法處理卵巢皮質(zhì)碎片后再分選DEAD-box containing ATP-dependent RNA helicase(DDX-4)陽性細胞[2]，由此獲得的細胞能夠表達生殖細胞特異性標記物且具有有絲分裂能力。然而2020年Wagner等[5]對人卵巢上皮組織進行的單細胞全轉(zhuǎn)錄組分析和抗原分析譜表明卵巢上皮組織中的細胞包括卵母細胞、顆粒細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞、血管周圍細胞和基質(zhì)細胞，而分選出的DDX-4陽性細胞并非OSCs而是血管周圍細胞。由于單細胞分析的精確性，這一結(jié)果不支持OSCs的存在，但DDX-4陽性細胞在一定條件下誘導產(chǎn)生了表達生殖細胞標記物的細胞，卵巢上皮組織中的DDX-4陽性細胞是否是OSCs仍需繼續(xù)進行深入的研究。Silvestris等[2]從育齡期及絕經(jīng)后女性卵巢上皮中分選出DDX-4陽性細胞，通過進一步測定分期特異性胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen 4，SSEA-4)的表達評估育齡期和絕經(jīng)期婦女來源的OSCs功能，絕經(jīng)后婦女SSEA-4的表達較育齡期女性低，但兩組均具有分化為單倍體OLCs的能力，在添加某些細胞因子條件下培養(yǎng)3周后得到表達生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF-9)、突觸復合蛋白3(synaptonemal complex protein 3，SYCP3)、發(fā)育多能相關(guān)蛋白3和其他生殖細胞表面標志物的OLCs，OLCs培養(yǎng)兩組比較差異無統(tǒng)計學意義。Zou等[6]報道了不同誘導辦法對雌性生殖干細胞產(chǎn)生OLCs的影響，結(jié)果顯示，細胞先應用懸滴法進行氣液界面培養(yǎng)再與顆粒細胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生了功能成熟的GV期卵母細胞?，F(xiàn)仍需更多的研究確定OSCs的存在，一旦證實其存在于卵巢中，即可為惡性腫瘤女性患者化療前生育力保存提供方法，并可能成為治療早發(fā)性卵巢功能不全的新型干細胞。

2 非卵巢來源干細胞

非卵巢來源干細胞包括間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)、胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)及皮膚衍生干細胞(skin-derived stem cells，SDSCs)等。此類干細胞雖然具有向生殖細胞分化能力，但需要提供特定的微環(huán)境。在卵泡成熟過程中，卵泡液內(nèi)富含蛋白質(zhì)、多糖、類固醇激素、生長因子、活性氧等，有利于卵母細胞的生長發(fā)育，因此在培養(yǎng)基中單獨或混合使用不同濃度(5%～25%)的人、牛和豬的卵泡液以模仿此微環(huán)境，再添加分化誘導劑，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenic protein，BMP)家族成員，視黃酸(retinoic acid，RA)和激活素A，成功獲得PGCLCs、濾泡樣細胞(follicle-like cells，F(xiàn)LCs)或OLCs[7]。卵母細胞的生長發(fā)育還取決于周圍是否存在促進其生長的健康細胞(例如顆粒細胞，卵泡膜細胞和卵丘細胞)，為了滿足這一要求，有研究采用共培養(yǎng)策略以獲得各種干細胞來源的體外衍生OLCs[8]。

2.1ESCs ESCs經(jīng)PGCLCs誘導產(chǎn)生OLCs是比較常用的方法，通過將ESCs誘導形成胚狀體后分選PGCLCs，再通過添加卵泡液或共培養(yǎng)等辦法誘導產(chǎn)生OLCs。Tanaka等[9]利用小鼠ESCs誘導產(chǎn)生PGCLCs后在不同培養(yǎng)條件下經(jīng)體外分化、體外生長和體外成熟得到功能成熟的卵子并在體外受精后產(chǎn)生健康的后代。2017年Jung等[10]研究顯示，在hESCs過表達生殖細胞特異性RNA結(jié)合蛋白deleted in azoospermia-like(DAZL)和Boule(DAZ家族成員之一)，多能性標記物八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(octamer-binding transcription factor-4，OCT4)、同源域蛋白(Nanog)等下調(diào)，減數(shù)分裂標志物PR結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白9基因及減數(shù)分裂特異性蛋白MLH1的上調(diào)，表明其使ESCs退出多能性并進入減數(shù)分裂，再添加GDF9、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenic protein，BMP15)后細胞被進一步誘導形成卵泡樣細胞，包括卵母細胞和顆粒細胞。轉(zhuǎn)錄組分析、卵泡標記物免疫染色和移植實驗表明，誘導所得的卵泡樣細胞與體內(nèi)類似。2020年Malik等[11]將山羊ESCs用骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenic protein，BMP4，)誘導后形成卵丘-卵母細胞復合物，該細胞復合物表達卵母細胞特異性標記物。而且在蛋白和mRNA水平均檢測到原始生殖細胞特異性標記物DDX-4、DAZL、STELLA的表達。雖然不同物種來源的ESCs均有誘導分化為OLCs的報道，但是其具體機制仍不清楚，需要進行更多更深入的研究。

2.2iPSCs iPSCs通過外源性基因轉(zhuǎn)染的辦法使體細胞去分化成為干細胞，已報道的體細胞包括皮膚成纖維細胞、外周血細胞、尿液細胞[12]，八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor-4，OCT4)、LIN28、性別決定區(qū)域Y同源盒基因2(Sex-determining region Y-bos2，SOX2)、NANOG在重編程過程中發(fā)揮了重要作用。人雄性生殖細胞可由多能干細胞(iPSCs/ESCs)產(chǎn)生，并在體內(nèi)分化為精母細胞樣細胞，但是iPSCs向雌性生殖細胞方向分化仍有許多問題需要解決。2017年Kojima等[13]用“兩階段”誘導法將iPSCs誘導分化為PGCLCs，先將iPSCs預誘導為早期中胚層樣細胞，再用添加了白血病抑制因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、干細胞因子、表皮生長因子的培養(yǎng)基誘導分化得到PGCLCs，但是進一步誘導產(chǎn)生雌性生殖細胞一直以來未取得進展。2017年有研究報道了小鼠iPSCs來源的PGCLCs在與小鼠卵巢體細胞形成的重組卵巢共培養(yǎng)后形成功能成熟的卵細胞，并產(chǎn)生健康后代[14]。2018年Yamashiro等[15]闡明將來源于人iPSCs的PGCLCs與小鼠胚胎卵巢體細胞重組的異種卵巢共培養(yǎng)4個月可獲得卵母細胞樣細胞，其表現(xiàn)了表觀遺傳重編程范圍內(nèi)的DNA去甲基化，部分無活性的X染色體有進行性去甲基化和再激活，但不表達γH2AX、DMCI和SYCP1蛋白，表明誘導產(chǎn)生的卵母細胞未進入減數(shù)分裂。2020年Yamashiro等[16]的進一步研究表明將iPSCs誘導為PGCLCs后移植到缺乏內(nèi)源性精子發(fā)生的新生小鼠睪丸中，有助于精子發(fā)生，由iPSCs誘導產(chǎn)生的PGCLCs在氣液界面條件下與小鼠胚胎卵巢體細胞聚集形成異種重組卵巢共培養(yǎng)約4個月后產(chǎn)生表達視黃酸激活基因8(retinoic acid gene 8，STRA8)、REC8(減數(shù)分裂特異性基因)、染色體1B的結(jié)構(gòu)維持基因(SMC1B)等視黃酸反應性胎兒生殖細胞的特征基因，闡明產(chǎn)生了進入減數(shù)分裂期的卵母細胞前體細胞。到目前為止，這是唯一一種從人iPSCs中產(chǎn)生進入減數(shù)分裂的卵母細胞樣細胞的方法，可此辦法的誘導效率僅為10%，還需進行更多深入的研究明確發(fā)生機制并提高誘導效率。

2.3MSCs 來源包括臍帶、骨髓、脂肪、月經(jīng)血、羊膜等，可分化為多種間質(zhì)組織，如骨骼、軟骨、脂肪、骨髓造血組織等，在造血細胞移植、骨軟骨損傷修復、炎性疾病、自身免疫性疾病等發(fā)面取得了巨大進展[17]。在女性生殖領域，MSCs與羊水干細胞多被用作早發(fā)性卵巢功能不全的細胞療法并有確切效果[18-21]，幾乎沒有向OLCs誘導的報道。Kim等[22]將在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的臍帶MSCs移植入切除卵巢后的大鼠中，2周后實驗組的雌二醇水平較對照組高，且mRNA和蛋白水平Nanos3，新生兒卵巢同源基因和LIM同源盒基因8的表達顯著增加，說明MSCs顯著改善卵巢功能。2019年Mirzaeian等[8]將小鼠腹膜MSCs與人卵泡液、卵丘細胞共培養(yǎng)獲得陽性表達卵母細胞標記物透明帶標記蛋白3、GDF9，生殖細胞標記物DDX-4、DAZL的OLCs。2020年Alifi等[23]從健康人胎盤獲得羊膜MSCs，用視黃酸處理14 d后檢測原始生殖細胞標記物C-kit，SSEA4，DDX-4高表達，OCT4低表達，說明誘導產(chǎn)生PGCLCs。Taheri等[7]從應用輔助生殖技術(shù)的婦女卵泡液中分離MSCs并用BMP15誘導培養(yǎng)21 d，獲得了陽性表達透明帶標記蛋白2、透明帶標記蛋白3的OLCs，但是不具備完善的生殖細胞功能，但是同類型研究報道較少。由于MSCs的間質(zhì)組織分化特性，很少用其誘導產(chǎn)生OLCs，但是用于治療早發(fā)性卵巢功能不全的效果已經(jīng)得到有力的證實，或該進行更多臨床實驗。

2.4SDSCs 已有來源于小鼠和豬SDSCs誘導分化為OLCs的報道。Dyce等[24]的前期實驗提出通過分化小鼠SDSCs來形成PGCLCs和更高級的OLCs，但是減數(shù)分裂無法啟動，后期實驗提出RA是功能性配子形成的關(guān)鍵驅(qū)動力，在干細胞向生殖細胞分化過程中添加RA可改善OLCs進入減數(shù)分裂的過程。Yan等[25]的研究結(jié)果也表明RA可以降低U0126(一種細胞外信號調(diào)節(jié)激酶特異性抑制劑)活性，進而細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白依賴性激酶2的表達增加，故促進PGCLCs增殖?？傊壳暗难芯空f明體外培養(yǎng)體系不足以支持從SDSCs誘導產(chǎn)生成熟的功能完備的卵母細胞。

3 極小胚胎樣干細胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)

VSELs是最原始的干細胞，與ESCs相比，在表觀遺傳和發(fā)育上更成熟，其來源廣泛，包括卵巢/睪丸、骨髓、外周血等，直徑3～7 μm，故在細胞分選上有較高要求，常因離心機轉(zhuǎn)速選擇不當致細胞丟失。VESLs優(yōu)勢有：表達OCT-4A、SOX-2、NANOG、SSEA-1(人類中SSEA-4)等類似ESCs的多能性基因，表達OCT-4B、SCA-1(人類中CD133)、DDX-4等PGCs特異性表面標志物、在不使用細胞飼養(yǎng)層或病毒轉(zhuǎn)染即可具有離體增殖能力、在化療后仍可存活并保留向OLCs分化能力[26]。成人體內(nèi)的VSELs處于靜止狀態(tài)，當有器官損傷時活化的VSELs可通過動員外周血促進受損器官組織的再生，由于VSELs的靜止性質(zhì)，其可以避免核和線粒體突變，因此可以作為生殖醫(yī)學中更安全的治療選擇[27]。不同組織來源的VSELs具有類似的mRNA、蛋白表達譜，其在生物學上無明顯差異。Virant-Klun[28]檢查了由VSELs誘導獲得的OLCs細胞受精能力，結(jié)果顯示OLCs能識別精子并釋放出透明帶樣結(jié)構(gòu)，但不能進行受精，表明由VSELs誘導分化獲得的OLCs功能不健全。也有報道表明在復發(fā)性卵巢癌腹水中的細胞主要為VSELs，提示VSELs在卵巢癌發(fā)生中可能有一定作用。在VSELs分選、誘導分化為OLCs并使其具有成熟功能等方面仍需進行更多的探索。

4 總結(jié)與展望

干細胞體外分化為OLCs需要一系列過程，包括多能性退出、形態(tài)改變(圓形卵母細胞樣細胞形態(tài))、早期和晚期PGCLCs標志物表達、減數(shù)分裂進入、卵母細胞特異性標記物表達、透明帶的發(fā)育以及卵丘-卵母細胞復合物的形成和細胞大小的生長。在特定的條件下干細胞具有分化為許多譜系的能力，干細胞來源的選擇與分化方案的選擇同等重要，在開始任何譜系特異性分化之前，需選擇最合適的細胞來源。OLCs體外誘導來源主要包括OSCs、ESCs、iPSCs、MSCs、VSELs等。OSCs有自發(fā)向OLCs分化的潛力，具有更高的分化效率，在確定其存在后可以成為新型干細胞模型及治療選擇。與MSCs相比，ESCs和iPSCs具有更大的OLCs分化能力，iPSCs來源于容易獲得的體細胞且具有類似于ESCs的特征，避免了倫理問題，ESCs及iPSCs的安全性均有待研究。此外，極小胚胎樣干細胞也被用于體外衍生OLCs，VSELs可以在化療中存活，這使極小胚胎樣干細胞成為更有價值的細胞來源，但是，由于細胞產(chǎn)率低且需要復雜的分離方法、確認標準，VSELs的規(guī)模有限，利用其產(chǎn)生功能成熟的卵母細胞仍有很多的困難與挑戰(zhàn)。盡管有這些進展，利用干細胞技術(shù)探究卵母細胞的發(fā)生調(diào)控機制仍有很多空白。在治療早發(fā)性卵巢功能不全等疾病中，干細胞的直接使用(未分化狀態(tài))由于其低免疫原性，旁分泌信號和歸巢能力而也仍有很大爭議?？傊?，干細胞體外誘導分化產(chǎn)生卵子的過程中缺乏體內(nèi)研究、無法產(chǎn)生健康后代，研究人員正在努力標準分化方案，使其更安全、更理想、更高效，OLCs在應用于臨床之前，仍需進行更多更深入的研究使其發(fā)揮全部功能。