車霄楠 沙 巖 王 丹 （徐州市兒童醫(yī)院，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院口腔科，徐州221000）

嬰幼兒血管瘤（infantile hemangioma，IH）是新生兒期最常見的良性腫瘤，由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其支持組織良性增生所致，患病率占初生嬰兒的4%~5%［1-2］。隨著患兒生長發(fā)育，病變組織可逐漸消褪，亦可隨之逐漸發(fā)育成熟，內(nèi)皮細(xì)胞逐漸形成血管，即形成由多個(gè)發(fā)育不完全的扭曲血管構(gòu)成的腫物。雖然大多數(shù)病變可自然消退，但約12%的病例因并發(fā)癥需要治療，超過50%的未經(jīng)治療的血管瘤可能導(dǎo)致永久的后遺癥［3-4］。血管瘤的主要治療適應(yīng)癥包括危及生命的血管瘤、功能性血管瘤、潰瘍和嚴(yán)重的解剖變形［5］。

嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為異常的血管瘤細(xì)胞通過血管生成促進(jìn)組織新生血管化［6-8］。microRNAs（miRNAs）已成為血管發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在多種疾病過程中調(diào)控異常，這些短的、非編碼的RNA 分子可抑制基因表達(dá)，通過誘導(dǎo)切割或阻斷靶mRNA 的翻譯［9］。最近一項(xiàng)研究表明，chromosome 19 miRNA 簇（C19MC）在IH 組織和血液樣本中均過表達(dá)，鑒定C19MC 為IH 的候選生物標(biāo)志物［10-13］。miR-382 在 IH 中過表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn) IH 發(fā)展［14］。miR-130a 在 IH 中過表達(dá)，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成[15]。盡管如此，miRNA 在IH 中的作用尚需進(jìn)一步研究。circ-RNAs 是最近發(fā)現(xiàn)的一類參與多種生理過程的ncRNAs，已被證明是調(diào)控基因表達(dá)的miRNA 海綿［15-16］。一些 circRNAs mRNA 競爭相同的 miRNA結(jié)合位點(diǎn)以形成整合的網(wǎng)絡(luò)后轉(zhuǎn)錄調(diào)控，即競爭內(nèi)源性 RNAs（ceRNAs）網(wǎng)絡(luò)［17-18］。最近，circRNAs 的譜分析已在多種疾病特別是在腫瘤中被鑒定出來，如皮膚鱗狀細(xì)胞癌、卵巢上皮癌、基底細(xì)胞癌［19-21］。然而，關(guān)于IH 中circRNA 的研究還很少。因此，本研究主要對IH 細(xì)胞中miRNA 及circRNA 的表達(dá)及其潛在功能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究使用的miRNA 和circRNA測序數(shù)據(jù)分別是來自GEO 數(shù)據(jù)庫的GSE69136 和GSE98795 芯片。對于 miRNA，選取 GSE69136 芯片中的16 個(gè)樣本作為研究對象，其中12 個(gè)樣本來自患者血管瘤細(xì)胞，4 個(gè)樣本來自患者血管瘤組織臨近正常皮膚細(xì)胞；對于circRNA，選取GSE98795 芯片中血管瘤組織和臨近正常皮膚組織各4個(gè)樣本進(jìn)行分析研究。

1.2 miRNA 差異分析 使用GEO2R 工具，對GSE69136 芯片中miRNA 測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。對分析結(jié)果，刪除參數(shù)殘缺的數(shù)據(jù)項(xiàng)，設(shè)置變數(shù)倍數(shù)和P值進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)的miRNA（DEMis）。

1.3 circRNA 差異分析 使用GEO2R 工具，對GSE98795 芯片中circRNA 測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。對分析結(jié)果，刪除參數(shù)殘缺的數(shù)據(jù)項(xiàng)，設(shè)置變數(shù)倍數(shù)和P值進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)的circ-RNA（DECis）。

1.4 預(yù)測miRNA-circRNA 相互作用關(guān)系 RNAhy‐brid 是 Behmsmeier M 等基于 miRNA 和靶基因二聚體二級(jí)結(jié)構(gòu)開發(fā)的miRNA 靶基因預(yù)測工具［22］。本研究從miRBase 獲取人類miRNA 序列文件，從circ‐Base 獲取 DECis 的序列文件，使用 RNAhybrid 預(yù)測工具預(yù)測能夠與DECis靶向結(jié)合的人類miRNA。對預(yù)測的結(jié)果，保留DEMis 參與的相互作用對，使用Cytoscape軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 DEMis 的 KEGG 通路分析 使用David 6.8（http：//david. ncifcrf. gov/tools. jsp）進(jìn)行差異基因Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。以P<0.05 為顯著性富集，統(tǒng)計(jì)每個(gè)Path‐way 中的差異基因數(shù)目。通過KEGG 顯著性富集分析，確定DEMis參與的主要通路。

2 結(jié)果

2.1 miRNA 差異分析 對GEO2R 的分析結(jié)果以P<0.05，|log2FC|>1（fold change，F(xiàn)C）為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的miRNA，與正常皮膚細(xì)胞相比，血管瘤細(xì)胞中共得到139個(gè)DEMis，其中128個(gè)上調(diào)miRNAs，11 個(gè)下調(diào) miRNAs（圖 1）。進(jìn)一步按照|log2FC|>5 和P<0.05 分別篩選到 55 個(gè)上調(diào) miRNAs 和 5 個(gè)下調(diào)miRNAs。按照差異miRNA倍數(shù)排序，表1列舉了前10個(gè)上調(diào)miRNAs和前10個(gè)下調(diào)miRNAs的信息。

表1 血管瘤細(xì)胞中上調(diào)/下調(diào)差異表達(dá)顯著的miRNAsTab.1 miRNAs with significantly up-regulated/downregulated expressions in hemangioma cells

圖1 血管瘤細(xì)胞miRNAs火山圖Fig.1 Volcanic plot of miRNAs in hemangioma cells

2.2 circRNA 差異分析 對GEO2R 的分析結(jié)果以P<0.05，|log2FC|>1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的circ-RNA，與正常皮膚細(xì)胞相比，血管瘤細(xì)胞中共得到1 000 個(gè) DECis，其中 581 個(gè)上調(diào) circRNAs，419 個(gè)下調(diào)circRNAs（圖2）。進(jìn)一步按照|log2FC|>2 和P<0.05 分別篩選到 151 個(gè)上調(diào) circRNAs 和 52 個(gè)下調(diào)circRNAs。按照差異circRNA 倍數(shù)排序，表2列舉了前 10 個(gè) 上 調(diào) circRNAs 和 前 10 個(gè) 下 調(diào) circRNAs 的信息。

表2 血管瘤細(xì)胞中上調(diào)/下調(diào)差異表達(dá)顯著的circRNAsTab.2 circRNAs with significantly up-regulated/downregulated expressions in hemangioma cells

圖2 血管瘤細(xì)胞circRNAs火山圖Fig.2 Volcanic plot of circRNAs in hemangioma cells

2.3 構(gòu)建miRNA-circRNA 相互作用關(guān)系 將DECis 和人類miRNA 的序列文件上傳至RNAhybrid工具，設(shè)置配對次數(shù)為1，能量閾值-30，miRNA 5'端2~7 nt 完全配對，預(yù)測得到354 條相互作用關(guān)系，共涉及81個(gè)DEMis和35個(gè)DECis（圖3）。

圖3 血管瘤細(xì)胞中miRNA-circRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 miRNA-circRNA interaction network in hemangioma cells

2.4 DEMis 的KEGG 通路分析 對血管瘤細(xì)胞中篩查出來的139 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行KEGG通路分析，以P<0.001 為標(biāo)準(zhǔn)篩查，有10.07%差異表達(dá)的miRNAs 富集在癌癥發(fā)生通路中，分別為miR520A、miR625、miR222、miR200A、miR203A、miR200B、miR200C、miR205、miR143、miR141、miR135B、miR150、miR23C、miR324，KEGG 通路分析顯示這些miRNAs 參與了肺癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、膀胱癌及前列腺癌的信號(hào)通路，表明這些差異表達(dá)的miRNAs 可能在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

3 討論

IH 是內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞異常增殖引起的嬰幼兒最常見的良性血管瘤，具有典型的先快速增殖后緩慢消退的生長特點(diǎn)［2，23］。IH 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為異常的血管瘤細(xì)胞通過血管生成促進(jìn)組織新生血管化［6-8］。近年來，非編碼RNA對腫瘤發(fā)生發(fā)展作用的機(jī)制受到極大關(guān)注。miRNA 雖然是非編碼RNA，但其轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控發(fā)生在大量的細(xì)胞過程中，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管生成［24-30］。且miRNA表達(dá)模式的改變與許多病理過程甚至一些癌癥的發(fā)生相關(guān)［31-35］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs已成為血管發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在多種疾病過程中可抑制基因表達(dá)，通過誘導(dǎo)切割或阻斷靶mRNA的翻譯［9，36］。隨著對 miRNA 的深入探索，多種 RNA分子對miRNA 的吸附作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，這種作用使miRNA 成為復(fù)雜調(diào)節(jié)鏈中重要的一環(huán)，這樣有競爭結(jié)合miRNA 引發(fā)的調(diào)節(jié)機(jī)制被稱為ceRNA 機(jī)制。其中，circRNA 作為 miRNA 海綿，在 ceRNA 機(jī)制中發(fā)揮重要作用，miRNA-circRNA 作為腫瘤生物標(biāo)記物的研究也越來越多。本研究主要通過分析IH 相關(guān)的miRNA 及circRNA 的高通量測序芯片，構(gòu)建miRNA-circRNA 相互作用關(guān)系，探索血管瘤潛在的生物標(biāo)記物。通過GSE69136數(shù)據(jù)分析miRNA 差異表達(dá)，最終得到139 個(gè)DEMis，其中大部分DEMis 為表達(dá)上調(diào)miRNAs。進(jìn)一步的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些DEMis 中有14 個(gè)miRNAs 富集在癌癥發(fā)生通路。通過GSE98795數(shù)據(jù)分析circRNA 差異表達(dá)，在血管瘤細(xì)胞中共得到1 000 個(gè)DECis，其中581 個(gè)上調(diào) circRNAs，419 個(gè)下調(diào) circRNAs。進(jìn)一步根據(jù)|log2FC|>2 和P<0.05，分別篩選到 151 個(gè)上調(diào) circ-RNAs 和 52 個(gè)下調(diào) circRNAs。將 DECis 和人類 mi-RNA 的序列文件上傳至RNAhybrid 工具，預(yù)測得到354 條相互作用關(guān)系，共涉及 81 個(gè) DEMis 和 35 個(gè)DECis。對 DEMis 的 KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，有 14 個(gè)差異miRNA 富集在癌癥發(fā)生通路中。通路分析顯示這些miRNAs 參與了肺癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、膀胱癌及前列腺癌的信號(hào)通路，表明這些miRNAs 可能在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，通過對GEO 數(shù)據(jù)庫中的IH 芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，本研究獲取了IH 中差異表達(dá)的mi-RNAs 和circRNAs。通過信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，在IH 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用的信號(hào)通路為癌癥發(fā)生信號(hào)通路，關(guān)鍵miRNAs 可能為miR520A、miR625、miR222、miR200A、miR203A、miR200B、miR200C、 miR205、miR143、miR141、miR135B、miR150、miR23C、miR324，這為探索 IH 的發(fā)生機(jī)制提供重要依據(jù)。