周蒙恩 張 娜 闕任燁 林柳兵 李 勇 （上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，上海200071）

肝臟是人體重要的消化器官，肝細(xì)胞是控制系統(tǒng)代謝需求、電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)和肝臟解毒過(guò)程的中央調(diào)節(jié)器［1-2］。急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是一種多因素復(fù)雜的炎癥性疾病，報(bào)告表明病毒感染、藥物濫用、酒精中毒、食物中毒和輻射損害等均可導(dǎo)致ALI［3］。由于細(xì)胞、組織和功能破壞的增加，廣泛或持續(xù)的肝損傷可能導(dǎo)致肝衰竭或肝硬化，并與高死亡率相關(guān)［4］。肝損傷的治療仍然是當(dāng)代醫(yī)學(xué)最具挑戰(zhàn)性的問(wèn)題之一，需要開發(fā)治療ALI 的新療法［5］。柴胡已在治療肝臟疾病中應(yīng)用，柴胡皂苷-d（saiko‐saponin d，SSd）是柴胡的主要活性成分之一，具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化的作用［6］。前期實(shí)驗(yàn)研究表明SSd 可以抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和NLRP3 炎癥小體活化減輕ALI，但是ROS 的來(lái)源及NLRP3活化的機(jī)制尚不清楚［7］。本文通過(guò)H2O2誘導(dǎo)HL-7702 細(xì)胞氧化應(yīng)激，探討 SSd 對(duì)線粒體 ROS 的產(chǎn)生及NLRP3炎癥體表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝細(xì)胞系HL-7702 由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所惠贈(zèng)；SSd 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；MitoTEMPOL 購(gòu)自翌圣生物科技（上海）有限公司；H2O2、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海億凡生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；NLRP3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；ASC抗體、Caspase1 抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals 公司；β-actin 抗體、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RT-PCR 引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；線粒體膜電位（JC-1）、ATP、ROS 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；多功能酶標(biāo)儀Varioscan Flash 購(gòu)自上海百基生物科技有限公司；天能電泳儀EPS300購(gòu)自上海天能科技有限公司；光學(xué)顯微鏡（AE41）購(gòu)自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；Nanodrop2000 購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；S1000 PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基，恒溫37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2，每48 h 更換培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)瓶底約80%后，用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化傳代。將細(xì)胞懸液（2×105個(gè)/孔）接種于6 孔板。分組為H2O2模型組：200 μmo/lL H2O2作用 HL-7702 細(xì)胞 4 h 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖活化；MitoTEMPOL+H2O2組：50 μmo/lL MitoTEMPOL 作 用 HL-7702 細(xì) 胞 24 h 后 ，加 入200 μmo/lL H2O2作用4 h；SSd+H2O2組：SSd作用HL-7702細(xì)胞24 h后，加入200 μmo/lL H2O2作用4 h。

1.2.2 JC-1檢測(cè) 藥物干預(yù)HL-7702細(xì)胞后，除去培養(yǎng)液，使用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞1 次，加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液及JC-1 染色工作液（陽(yáng)性對(duì)照組加入CCCP 溶液），37℃ 孵育20 min 后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2 次，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液2 m/l孔，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 ATP 檢測(cè) 藥物干預(yù)HL-7702細(xì)胞后，除去培養(yǎng)液，加入裂解液，離心取上清，用ATP 檢測(cè)試劑稀釋液稀釋ATP 檢測(cè)試劑，4℃保存。用ATP 檢測(cè)裂解液將 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液按照 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmo/lL的濃度梯度依次稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。加100 μl ATP 檢測(cè)工作液到檢測(cè)孔內(nèi)，室溫放置5 min，消耗本底性的ATP。在檢測(cè)孔內(nèi)加上20 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè) 將藥物干預(yù)后的HL-7702 細(xì)胞，使用PBS 緩沖液充分洗滌后，收集于稀釋好的DCFH-DA 中，37℃孵育20 min，期間每隔3~5 min混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，分別用活性氧陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞30 min、H2O2刺激細(xì)胞4 h 同步完成，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) NLRP3、ASC、Caspase1 炎癥體表達(dá) 使用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白含量。細(xì)胞蛋白經(jīng)變性后，以SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳分離膠分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，經(jīng)5%的脫脂奶粉搖床上慢搖2 h封閉后，除去封閉液，用TBST 漂洗，加入NLRP3 抗體、ASC 抗體、Caspase1 抗體 4℃ 過(guò)夜孵育，回收一抗，用 TBST 漂洗，室溫孵育二抗 2 h，用 TBST 漂洗后，進(jìn)行ECL 光化學(xué)顯色。最后應(yīng)用Image J 分析軟件對(duì)掃描條帶進(jìn)行定量分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 RT-PCR 檢測(cè) NLRP3、ASC、Caspase1 炎癥體表達(dá) 采用TRIzol 試劑提取總RNA，Nanodrop2000檢測(cè) RNA 的純度和濃度，各組取 2 μl 總 RNA，按20 μl 總反應(yīng)體積，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA 為模板分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，NLRP3 上游引物5'-TT‐GACTTCCGCAAGGACCTCGG-3'，下游引物 5'-GC‐GCCCGGGTTATGCTGCTGGT-3'，ASC 上游引物 5'-GGCTGCTGGATGCTCTGTA-3'，下游引物 5'-AGGCTGGTGTGAAACTGAAGA-3'，Caspase1 上游引物 5'-CAGACAAGGGTGCTGAACAA-3'，下游引物 5'-TC‐GGAATAACGGAGTCAATCA-3'，β-actin 上游引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'，采用三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，得到各樣本Ct值，然后利用2-ΔΔCt計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0 軟件、Image J、GraphPad5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、作圖，數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANO‐VA），均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSd 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HL-7702 細(xì)胞線粒體功能的影響

2.1.1 SSd 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 HL-7702 細(xì)胞 JC-1 的影響 與對(duì)照組相比，H2O2作用于HL-7702細(xì)胞，線粒體膜電位明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MitoTEMPOL、SSd 干預(yù)后，與 H2O2組相比，線粒體膜電位明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。H2O2對(duì)HL-7702的氧化應(yīng)激損傷使線粒體膜電位有下降趨勢(shì)，MitoTEMPOL、SSd 干預(yù)后抑制了 H2O2對(duì) HL-7702細(xì)胞線粒體膜電位的下調(diào)。見(jiàn)圖1。

圖1 MitoTEMPOL、SSd 對(duì) H2O2 誘導(dǎo) HL-7702 細(xì)胞 JC-1的影響Fig.1 Effect of MitoTEMPOL and SSd on JC-1 of HL-7702 cells induced by H2O2

2.1.2 SSd 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 HL-7702 細(xì)胞 ATP 的影響 與對(duì)照組相比，H2O2作用于HL-7702 細(xì)胞，ATP明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MitoTEM‐POL、SSd 干預(yù)后，與H2O2組相比，ATP 明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。H2O2對(duì) HL-7702 的氧化應(yīng)激損傷使 ATP 生成減少，MitoTEMPOL、SSd 干預(yù)后則使ATP生成增多。見(jiàn)圖2。

圖2 MitoTEMPOL、SSd 對(duì) H2O2 誘導(dǎo) HL-7702 細(xì)胞 ATP變化Fig.2 Effect of MitoTEMPOL and SSd on ATP changes in HL-7702 cells induced by H2O2

2.1.3 SSd 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 HL-7702 細(xì)胞 ROS 的影響 與對(duì)照組相比，H2O2作用于HL-7702細(xì)胞，Mito‐SOX Red熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即ROS升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MitoTEMPOL、SSd干預(yù)后，與H2O2組相比，MitoSOX Red 熒光強(qiáng)度下降，即ROS 生成降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與2.1.1 線粒體功能狀態(tài)結(jié)合來(lái)看，H2O2作用于HL-7702細(xì)胞，細(xì)胞線粒體功能下降，ROS 升高，MitoTEMPOL、SSd 干預(yù)后能抑制H2O2誘導(dǎo)的HL-7702 細(xì)胞ROS 的升高。見(jiàn)圖3。

圖3 MitoTEMPOL、SSd 對(duì) H2O2 誘 導(dǎo) 的 HL-7702 細(xì) 胞ROS的影響Fig.3 Effect of MitoTEMPOL and SSd on ROS of HL-7702 cells induced by H2O2

2.2 SSd 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 HL-7702 細(xì)胞 NLRP3 炎癥體表達(dá)的影響

2.2.1 SSd 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 HL-7702 細(xì)胞 NLRP3 炎癥體蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，H2O2作用于HL-7702 細(xì)胞，NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05、P<0.01）；MitoTEM‐POL、SSd 干預(yù)后，與H2O2組相比，NLRP3、ASC、Cas‐pase1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 MitoTEMPOL、SSd 對(duì) HL-7702 細(xì)胞 NLRP3 炎癥體蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of MitoTEMPOL and SSd on expression of NLRP3 inflammatory body protein in HL-7702 cells

2.2.2 SSd 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 HL-7702 細(xì)胞模型 NL‐RP3 炎癥體mRNA 表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，H2O2作用于HL-7702細(xì)胞，NLRP3、ASC、Caspase1基因表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Mito-TEMPOL、SSd 干預(yù)后，與H2O2組相比，NLRP3、ASC、Caspase1 基因表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 MitoTEMPOL、SSd 對(duì) HL-7702 細(xì)胞 NLRP3 炎癥體基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of MitoTEMPOL and SSd on expression of NLRP3 inflammatory body gene in HL-7702 cells

3 討論

肝臟具有物質(zhì)合成分解代謝、生物轉(zhuǎn)化和內(nèi)外分泌等功能，易受到各種致病因素和刺激因子的侵襲，引起肝臟的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生損傷［8］。研究表明氧化應(yīng)激在肝臟疾病中發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)［9］。氧化應(yīng)激是指細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生超過(guò)了細(xì)胞自身所能清除的能力而引起的應(yīng)激損傷［10］。正常情況下，低濃度的ROS 是細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和信號(hào)傳遞所必需的，然而過(guò)量的ROS 會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致隨后的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 的氧化損傷，促使炎癥因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，也是引起肝硬化、肝纖維化的重要機(jī)制［11-12］。

NLRP3 炎癥體是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠識(shí)別各種應(yīng)激、外源微生物和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，刺激細(xì)胞因子釋放，使炎癥細(xì)胞活化，從而在多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［13］。NLRP3 炎癥體主要是由 NLRP3、ASC、Cas‐pase1 三者相互作用，形成的一個(gè)同心的組織，其中ASC 層包圍著 NLRP3 蛋白，而 Caspase1 則附著在外面的 ASC 層上［14］。NLRP3 的炎癥體已被報(bào)道與急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，在丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎、肝纖維化、肝臟缺血/再灌注損傷等急慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都存在著NLRP3炎癥體的活化［15-20］。NLRP3炎癥體活化后，產(chǎn)生有活性的Caspase1，導(dǎo)致IL-1β和IL-18的釋放，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［21］。

為深入探究SSd抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體活化減輕ALI 的機(jī)理，本研究采用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷模型，使用線粒體靶向抗氧化劑Mito‐TEMPOL 清除線粒體來(lái)源的ROS，尋找ROS 與NL‐RP3 炎癥體的關(guān)系，并使用SSd 干預(yù)探究其作用機(jī)制［22-23］。結(jié)果提示 H2O2對(duì) HL-7702 的氧化應(yīng)激損傷使線粒體膜電位有下降趨勢(shì)，ATP 生成減少，Mito‐SOX Red 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，ROS 生成增多，NLRP3、ASC、Caspase1蛋白及基因表達(dá)明顯上調(diào)；使用Mito‐TEMPOL 干預(yù)后，抑制了 H2O2對(duì) HL-7702 細(xì)胞線粒體膜電位的下降、ATP 生成的減少、MitoSOX Red 熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)、ROS 的生成，同時(shí)伴隨著NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白及基因表達(dá)的下調(diào)。提示使用MitoTEMPOL清除線粒體來(lái)源ROS后，NLRP3、ASC、Caspase1蛋白及基因表達(dá)明顯下調(diào)。說(shuō)明了NLRP3炎癥體表達(dá)與線粒體來(lái)源ROS 相關(guān)性，線粒體來(lái)源的ROS 是NLRP3 炎癥體活化的上游調(diào)節(jié)信號(hào)。同時(shí)，SSd 也能達(dá)到同樣的作用，提示SSd 可以保護(hù)H2O2誘導(dǎo)HL-7702 細(xì)胞線粒體的功能損傷，清除線粒體來(lái)源的ROS，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SSd 能通過(guò)下調(diào)線粒體ROS-NLRP3信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化、抗炎的作用。

ROS 作為細(xì)胞內(nèi)第二信使參與了NLRP3 的活化，ROS 是一個(gè)重要的上游信號(hào)調(diào)節(jié)炎癥體NLRP3的活化，但ROS 的來(lái)源和調(diào)控仍不清楚［24-26］。ROS可由細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體和線粒體以及NADPH 氧化酶等產(chǎn)生，其中線粒體ROS 來(lái)源占細(xì)胞內(nèi)ROS 的大部分，且線粒體來(lái)源的ROS 對(duì)NLRP3 炎癥體的激活在動(dòng)物模型及細(xì)胞模型中所證實(shí)，與本研究結(jié)果一致［27-31］。

前期研究發(fā)現(xiàn)SSd 可以抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和NLRP3 炎癥體活化從而減輕ALI，然而作用途徑未知。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)的HL-7702細(xì)胞中線粒體來(lái)源的ROS是NLRP3炎癥體活化的上游調(diào)節(jié)信號(hào)，SSd 可以減少線粒體ROS 的產(chǎn)生，抑制NLRP3 炎癥體蛋白及基因的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化、抗炎的作用。本研究為SSd 治療ALI 的潛在療效提供了新的證據(jù)，為進(jìn)一步研發(fā)應(yīng)用提供了更多的基礎(chǔ)研究支持。