王鴻利 何 琴 劉 帆 袁 霞 張 勤

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院老年內(nèi)五科，成都610072）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，以?xún)?nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）為初始靶點(diǎn)，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙從而引發(fā)炎癥［1-3］。有研究表明雙特異性磷酸酶 6（dual-specificity phosphatase 6，DUSP6）參與炎癥相關(guān)生理過(guò)程并促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而抑制DUSP6 過(guò)表達(dá)是有效的消炎療法［4-6］。microRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，具有約22 個(gè)核苷酸，通過(guò)與mRNA 的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合來(lái)抑制基因的翻譯或誘導(dǎo)mRNA 切割，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)［7］。miRNA 已被證明參與多種炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)并且部分RNA 可參與調(diào)節(jié)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的血管壁炎癥［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)miR-145-5p 可通過(guò)多種途徑緩解體內(nèi)炎癥反應(yīng)，但其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程的調(diào)節(jié)還未見(jiàn)報(bào)道［11-12］。脂多糖（lipo‐polysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起白細(xì)胞滲透進(jìn)入血管壁，并增加血管通透性，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑［13］。在本研究中，以LPS 誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）為炎癥損傷模型，探討了miR-145-5p對(duì)血管EC 氧化損傷和炎癥的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)的分子機(jī)制，旨在為動(dòng)脈粥樣硬化引起的EC 損傷治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs 來(lái)自美國(guó)ATCC。LPS、高葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Sigma公司；鏈霉素和青霉素購(gòu)自HyClone 公司；pcDNA、miR‐NC、pcDNA-DUSP6、miR-145-5p mimic、pMIR 報(bào)告質(zhì)粒載體及試驗(yàn)所用序列購(gòu)自RiboBio 公司；Lipo‐fectamine2000 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；試驗(yàn)所用抗體均購(gòu)自上海艾博抗生物科技有限公司；BCA 試劑盒，iNOS 檢測(cè)試劑盒和IL-10 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自合肥萊爾生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；組織蛋白提取試劑盒購(gòu)自Foregene公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、TRIzol 試劑盒、熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pro‐mega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（含鏈霉素、青霉素雙抗），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至生長(zhǎng)約80%后傳代，取4~5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞模型建立 將HUVECs 細(xì)胞以 5×105個(gè)/ml 的密度接種于 12 孔板中培育至約80%匯合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別進(jìn)行pcDNA、miR-NC、pcD‐NA-DUSP6、miR-145-5p mimic轉(zhuǎn)染和pcDNA-DUSP6與miR-145-5p mimic共轉(zhuǎn)染。將DUSP6 mRNA 的編碼區(qū)克隆到pcDNA3.1（+）載體中。所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序均使用Lipofectamine2000進(jìn)行。

1.2.3 體外細(xì)胞模型建立 轉(zhuǎn)染成功后收獲細(xì)胞，非Control組細(xì)胞進(jìn)行LPS 誘導(dǎo)（2 h）以建立炎癥損傷模型。當(dāng)天誘導(dǎo)試驗(yàn)完成后吸去細(xì)胞培養(yǎng)基隨即加入新鮮的無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基后孵育12 h。實(shí)驗(yàn)分組：Control 組、LPS 組、LPS+mimic 組、LPS+DUSP6 組和LPS+mimic+DUSP6 組。培養(yǎng)結(jié)束后分別收集5組細(xì)胞培養(yǎng)上清液置-80℃保存。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)方法 TRIzol 試劑盒抽提總mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶先合成cDNA，然后再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃ 先變性 3 min，然后 94℃1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，36 個(gè)循環(huán)，最后 72℃7 min。RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后用計(jì)算機(jī)圖像分析儀掃描，經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算相對(duì)mRNA 水平表達(dá)量。引物序列miR-145-5p：F 5'-CAGTCTTGTCCAGTTTTCCCAG-3'；R 5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTGTC-3'。DUSP6：F 5'-CAGTGGTGCTCTACGACGAG-3'；R 5'-GCAATGCAGGGAGAACTCGGC-3'。

1.2.5 雙重?zé)晒馑孛笇?shí)驗(yàn) TargetScan 軟件顯示DUSP6 是 miR-145-5p 的 靶 標(biāo) 之 一 。 DUSP6 野 生 型（DUSP6-WT）片段（包含潛在的結(jié)合位點(diǎn)）和相應(yīng)DUSP6 突變型（DUSP6-MUT）片段被插入miR-145-5p 的pMIR 報(bào)告質(zhì)粒載體，以產(chǎn)生DUSP6 螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體。然后，使用Lipofectamine 2000 試劑將載體和miR-145-5p 模擬物共轉(zhuǎn)染到HUVECs細(xì)胞中［14］。轉(zhuǎn)染24 h 后，使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞。記錄Rluc/Luc。

1.2.6 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激 細(xì)胞樣取上清液，按照SOD 檢測(cè)試劑盒和MDA 檢測(cè)試劑盒的操作要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析。

1.2.7 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子 細(xì)胞樣取上清液，按照iNOS 檢測(cè)試劑盒和IL-10 檢測(cè)試劑盒的操作要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 每組細(xì)胞樣品各取一份，用AnnexinV/PI 雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.9 Western blot 按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白提取，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將制備好的蛋白樣品加入10%的凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，取膜，將其加入封閉液中，保持20 min，用蒸餾水將一步法試劑盒中的10×洗液稀釋成1×洗液；取二抗HRP 至4 ml 離心管中，再取一抗與二抗混勻，室溫孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液。其中，一抗?jié)舛菳ax（1∶1 000），Bcl-2（1∶500），DUSP6（1∶1 000），一抗內(nèi)參Actin濃度（1∶1 000），二抗內(nèi)參Actin濃度（1∶500），去抗體混合液，用洗液漂洗3次，5 ml×5 min。ECL 顯色曝光，采用Image J 分析內(nèi)參Actin 和目標(biāo)條帶的灰度值，目標(biāo)條帶蛋白水平=目標(biāo)條帶的灰度值/Actin 的灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-145-5p 靶 向 DUSP6 HUVECs 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染pcDNA-DUSP6 后結(jié)果顯示，與 Control 組相比，pcD‐NA-DUSP6轉(zhuǎn)染組中DUSP6的相對(duì)mRNA 水平顯著升高（圖1A，P<0.05），而miR-145-5p 相對(duì)mRNA 水平顯著降低（圖1B，P<0.05），表明DUSP6 過(guò)表達(dá)HUVECs 細(xì)胞構(gòu)建成功。HUVECs 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic 后結(jié)果顯示，與 Control 組相比，miR-145-5p mimic 轉(zhuǎn)染組中 miR-145-5p 相對(duì) mRNA 水平顯著升高（圖1C，P<0.05），這表明miR-145-5p 成功轉(zhuǎn)染了HUVECs 細(xì)胞，并構(gòu)建了穩(wěn)定的miR-145-5p過(guò)表達(dá)HUVECs 細(xì)胞系。TargetScan 軟件預(yù)測(cè)miR-145-5p 可以直接結(jié)合到DUSP6 基因的3'-UTR 區(qū)（圖1D）。雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，miR-145-5p 可以顯著抑制DUSP6 3'-UTR-wt 載體的熒光強(qiáng)度，但不能抑制DUSP6 3'-UTR-mut載體的熒光強(qiáng)度（圖1E，P<0.05）。結(jié)果表明，miR-145-5p 和DUSP6具有良好的靶向關(guān)系。

圖1 miR-145-5p靶向DUSP6Fig.1 miR-145-5p targets DUSP6

2.2 miR-145-5p 過(guò)表達(dá)下調(diào)HUVECs 細(xì)胞中DUSP6 的表達(dá)水平 如圖 2A 所示，與 Control 組相比，LPS 組中miR-145-5p 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與 LPS 組相比，LPS+mimic 組中 miR-145-5p表達(dá)水平顯著升高，而LPS+DUSP6 組中miR-145-5p表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 miR-145-5p 表達(dá)水平顯著提升（P<0.05）。如圖2B 所示，與Control 組相比，LPS 組中 DUSP6 相對(duì) mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與 LPS 組相比，LPS+mimic 組中 DUSP6 相對(duì)mRNA 水平顯著降低，而 LPS+DUSP6 組中 DUSP6 相對(duì)mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 DUSP6 相對(duì) mRNA水平顯著降低（P<0.05）。如圖2C 所示，與Control組相比，LPS 組中DUSP6 相對(duì)蛋白水平顯著升高（P<0.05）。與 LPS 組相比，LPS+mimic 組中 DUSP6相對(duì)蛋白水平顯著降低，而LPS+DUSP6組中DUSP6相對(duì)mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 DUSP6 相對(duì)蛋白水平顯著降低（P<0.05）。表明miR-145-5p 過(guò)表達(dá)可下調(diào)HUVECs細(xì)胞中DUSP6的表達(dá)水平。

圖2 5組細(xì)胞中miR-145-5p和DUSP6的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of miR-145-5p and DUSP6 in 5 groups of cells

2.3 miR-145-5p 過(guò)表達(dá)可抑制HUVECs 細(xì)胞凋亡 如圖 3A 所示，與 Control 組相比，LPS 組中細(xì)胞凋亡率顯著提升（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中細(xì)胞凋亡率顯著下降，而LPS+DUSP6 組中細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中細(xì)胞凋亡率顯著下降（P<0.05）。如圖 3B 所示，與Control 組相比，LPS組中Bax/Bcl-2 比率顯著提升（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中 Bax/Bcl-2 比率顯著下降，而LPS+DUSP6 組 中 Bax/Bcl-2 比 率 顯 著 升 高（P<0.05）。與 LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6組中Bax/Bcl-2 比率顯著下降（P<0.05）。表明miR-145-5p過(guò)表達(dá)可抑制HUVECs細(xì)胞凋亡。

圖3 5組細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of 5 groups cells

2.4 miR-145-5p 過(guò)表達(dá)可緩解HUVECs 細(xì)胞氧化應(yīng)激 如圖 4A 所示，與 Control 組相比，LPS 組中SOD 含量顯著降低（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中 SOD 含量顯著上升，而 LPS+DUSP6 組中SOD含量則顯著降低（P<0.05）。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中SOD 含量顯著上升（P<0.05）。如圖 4B 所示，與 Control 組相比，LPS 組中MDA含量顯著上升（P<0.05）。與LPS組相比，LPS+mimic 組中 MDA 含量顯著下降，而 LPS+DUSP6 組中MDA 含量則顯著升高（P<0.05）。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中MDA 含量顯著降低（P<0.05）。表明miR-145-5p過(guò)表達(dá)可緩解HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激。

圖4 5組細(xì)胞氧化應(yīng)激情況Fig.4 Oxidative stress of 5 groups cells

2.5 miR-145-5p 過(guò)表達(dá)可緩解HUVECs 細(xì)胞炎癥損傷 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control 組相比，LPS 組中 iNOS 與 IL-10 相對(duì) mRNA 水平顯著升高（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+mimic 組中 iNOS 相對(duì)mRNA水平顯著降低，而IL-10相對(duì)mRNA水平顯著升高（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+DUSP6 組中iNOS 相對(duì) mRNA 水平顯著升高（P<0.05），而 IL-10相對(duì)mRNA水平無(wú)顯著性變化。與LPS+DUSP6組相比，LPS+mimic+DUSP6組中iNOS相對(duì)mRNA水平顯著降低，而IL-10相對(duì)mRNA水平顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖5A。

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與 Control 組相比，LPS 組中iNOS 與IL-10 含量均顯著升高（P<0.05）。與LPS組相比，LPS+mimic 組中iNOS 含量顯著降低，而IL-10 含量顯著升高（P<0.05）。與LPS 組相比，LPS+DUSP6 組中iNOS 含量顯著升高（P<0.05），而 IL-10含量無(wú)顯著性變化。與LPS+DUSP6 組相比，LPS+mimic+DUSP6 組中 iNOS 含量顯著降低，而 IL-10 含量顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖5B。表明miR-145-5p過(guò)表達(dá)可緩解HUVECs細(xì)胞炎癥損傷。

圖5 5組細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子含量Fig.5 Contents of inflammation related factors in 5 groups cells

3 討論

EC 功能障礙是引起多種心內(nèi)科疾病的主要原因，尤其是老年疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病等［15-17］。而內(nèi)皮功能障礙的主要特征是炎癥損傷。炎癥是由有害刺激（如感染和壞死組織）引起的基本的先天免疫反應(yīng)，通常以促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生為特征［18］。研究發(fā)現(xiàn)炎癥與人類(lèi)慢性疾病的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，并且炎癥通常伴隨氧化應(yīng)激等不良反應(yīng)。因此，炎癥過(guò)程的控制在預(yù)防相關(guān)疾病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

在這項(xiàng)研究中，以LPS誘導(dǎo)的HUVEC為炎癥損傷模型，探討了miR-145-5p 對(duì)氧化損傷和炎癥的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DUSP6在LPS誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞炎癥模型中高表達(dá)。這一結(jié)果與 ZHANG 等［6］的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)LPS處理巨噬細(xì)胞會(huì)上調(diào)DUSP6水平進(jìn)而觸發(fā)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而DUSP6 抑制劑則減輕了LPS 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［7］。在本研究中miR-145-5p 與DUSP6 抑制劑有著異曲同工的作用。并發(fā)現(xiàn)miR-145-5p 可以顯著抑制DUSP6 3'-UTR-wt 載體的熒光強(qiáng)度，但不能抑制DUSP6 3'-UTR-mut載體的熒光強(qiáng)度，預(yù)示著DUSP6 是miR-145-5p 調(diào)控的潛在靶標(biāo)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相似，過(guò)表達(dá)的miR-145-5p 下調(diào)了 DUSP6 的表達(dá)水平，同時(shí)，miR-145-5p 過(guò)表達(dá)降低了iNOS 相對(duì)mRNA 水平并使IL-10 含量顯著升高。預(yù)示miR-145-5p 可以通過(guò)下調(diào)DUSP6水平抑制LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞的炎癥損傷。GU 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，TUG1 抑制劑可以通過(guò)激活miR-145-5p/DUSP6 軸來(lái)緩解香煙煙霧引起的慢性阻塞性肺疾病炎癥和對(duì)氣道重塑的抑制作用。炎癥損傷過(guò)程中通常伴隨較為強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD 和MDA 是較為常見(jiàn)的氧化應(yīng)激標(biāo)志物。在本研究中LPS 組細(xì)胞中SOD 含量顯著降低而MDA 含量顯著上升。miR-145-5p 過(guò)表達(dá)顯著提高了HUVECs細(xì)胞中SOD含量并降低了MDA含量。

過(guò)度炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs 可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR-145-5p 亦包含在內(nèi)［12，20］。在本研究中 miR-145-5p 過(guò)表達(dá)可以降低HUVECs 細(xì)胞的Bax/Bcl-2 比率，預(yù)示miR-145-5p具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。

預(yù)防和控制炎癥反應(yīng)及其相關(guān)反應(yīng)的發(fā)生是預(yù)防EC 功能障礙的有效手段，對(duì)老年性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化，心血管疾病等都有很好的作用。在本研究中miR-145-5p 過(guò)表達(dá)可以通過(guò)下調(diào)DUSP6 水平緩解HUVECs細(xì)胞氧化應(yīng)激與炎癥損傷并抑制細(xì)胞凋亡。這預(yù)示DUSP6 是控制EC 炎癥障礙的潛在治療靶標(biāo)，而運(yùn)用miR-145-5p 調(diào)節(jié)是有前途的治療策略。